土贝母苷甲对人肺腺癌细胞增殖及凋亡的影响

苏甲林 赵参军 郑瑾

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都位居前列，且仍然呈上升趋势[1-2]。其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌约85%，而肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的亚型[3]。尽管非小细胞肺癌在早期诊断、预防和治疗上有所改善，但是，在过去几十年中各阶段非小细胞肺癌的5年总生存率并没有显著改变[4-5]。目前，外科手术、化放疗、分子靶向治疗和免疫治疗等方法已广泛应用于肺癌，并取得了较好的疗效[6-10]。但对于无手术、放疗适应症、化疗耐药及出现无法耐受毒副作用的患者，中医药有一定的优势，其对于调整机体整体平衡，改善放、化疗治疗的毒副反应，提高患者生存时间和生存质量具有重要意义[11-12]。土贝母是我国一种传统中药，以鳞茎入药，性味苦，畏寒，归肺、脾经，有散结、消肿、解毒之功效[13-14]。研究人员利用多种色谱分离手段，分离土贝母根茎得到了30种化合物[13, 15]。土贝母中皂苷占比例较大，也是主要的活性成分之一，其中，土贝母苷甲(Tubeimoside-1，TBMS1)是一种聚完三萜皂苷，具有良好的水溶性[11, 16]。体外实验研究显示土贝母苷甲对多种癌细胞的生长均有明显的抑制效果[14, 17-18]。本实验以土贝母苷甲为主要研究对象，MTS法观察土贝母苷甲对人肺腺癌细胞的体外生长抑制作用，使用流式细胞仪观察土贝母苷甲对A549细胞周期及凋亡变化，Western blot 检测土贝母苷甲对Caspase通路蛋白表达变化，探讨土贝母苷甲对人肺腺癌细胞的增殖及凋亡作用，为进一步研究土贝母苷甲治疗肺腺癌的临床应用奠定实验基础。

资料与方法

一、材料

人肺腺癌细胞株(A549)购自上海细胞库，F-12K Nutrient Mixture 培养基(F-12K)、胎牛血清、胰酶均购自Gibco公司；MTS购自美国promega公司；Annexin V-FITC和Propidium Iodide购自美国eBioscience公司；无菌操作台、CO2培养箱，低温高速离心机和酶标仪均购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司；用于Western blot的caspase-9、caspase-3、PARP抗体够自美国 Cell Signaling Technology公司，山羊抗小鼠二抗 、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(P0202)、RIPA裂解液(P0013)、蛋白分子量标准(P0061)购于碧云天公司。土贝母苷甲购自天津一方科技有限公司。

二、实验方法

1 土贝母苷甲母液配制

用天平称取土贝母苷甲10 mg溶解5 mL已灭菌的PBS溶液中，待完全溶解后用0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。

2 细胞培养

人肺腺癌细胞A549用含10%胎牛血清的F-12K培养基于5% CO2，37℃恒温培养，倒置相差显微镜下观察细胞均匀分布，每两天更换新鲜培养基一次，待细胞融合度达到约90%时按1 ∶3进行传代。

三、体外抗肿瘤活性测定

1 MTS法测定土贝母苷甲对A549细胞生长抑制率

将处于对数生长期的A549细胞以1 000个细胞每孔接种到96孔板中，待细胞融合度达到70%～80%时，更换培养基，并在新的培养基中按照下列浓度为终浓度加入土贝母苷甲储液(μg/mL)：0、1、2、5。每组设立3个重复孔，并设立空白孔；隔天更换培养液，培养4天，维持土贝母苷甲浓度，每天固定时间点取出1个96孔板，每孔加入20μl MTS试剂，并置于37℃培养箱中继续孵育2 h。使用全自动酶标仪检测490 nm处吸光度值(OD值)。

2 土贝母苷甲对肺腺癌细胞A549周期分布的影响

采用流式细胞仪结合PI染剂检测分析各组细胞周期的变化：取处于对数生长期的细胞以2×105个细胞每孔种至6孔板中；使用含1 μg/mL土贝母苷甲培养基培养A549细胞48 h后作为处理组，对照组加入培养基培养48 h；使用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化两组细胞并收集于离心管中。将细胞于20℃，2 000 rpm离心5 min后，用预冷的PBS离心洗涤细胞，4℃，2 000 rpm，离心5 min，加入预冷的75%乙醇溶液于4℃冰箱中过夜固定；将细胞再次用预冷的PBS溶液洗涤离心后，将细胞重悬于含50 μg/mL的PI染剂和50 μg/mL的RNase A溶液中，置入37℃水浴箱中孵育约30 min后用流式细胞仪进行细胞周期的检测。

3 土贝母苷甲对肺腺癌细胞A549凋亡率的影响

采用流式细胞仪结合Annexin FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡变化：取处于对数生长期的细胞以2×105个细胞每孔种至6孔板中；使用含1 μg/mL土贝母苷甲培养基培养A549细胞48 h后作为处理组，对照组加入培养基培养48 h；分别取1 mL细胞悬液用预冷的PBS离心洗涤细胞，4℃，2 000 rpm，离心5 min，共3次，弃去上清液；加入500 μL Annexin FITC及APC试剂并混匀后加入5 μL PI试剂并混匀，于室温下避光孵育15～20 min后用流式细胞仪进行检测；结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左上象限代表收集过程中出现的损伤细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，左下象限代表正常存活细胞，右下象限代表早期凋亡细胞。以早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞与坏死细胞之和为凋亡的细胞。

4 Western blot 检测土贝母苷甲对Caspase通路蛋白表达

将两组细胞接种至60 mm细胞培养皿中，于37℃、5% CO2条件下培养至对数生长期，使用含1 μg/mL土贝母苷甲培养基培养A549细胞48 h后作为处理组，对照组加入培养基培养48 h；收集两组细胞蛋白质，进行Western blot检测Caspase-9、Caspase-3和Parp在两组细胞中的表达情况。

四、统计分析

统计学分析采用SPSS Statistics 23对试验数据进行统计分析，数据采用平均值±标准差的形式表示，两组数据间比较采用t检验分析，多组数据采用单因素方差分析，多组之间两两比较采用LSD-t检验的方法P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、土贝母苷甲对A549细胞增殖的影响

利用MTS法检测土贝母苷甲对A549细胞增殖的影响，根据实验结果绘制细胞生长曲线，结果显示，各组细胞随培养时间的推移都呈现出增殖的趋势，随着土贝母苷甲浓度的增加，A549细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)，提示土贝母苷甲对A549细胞的增殖具有抑制作用(图1)。

图1 土贝母苷甲对A549细胞增殖能力的影响，*P<0.05

二、土贝母苷甲对人肺腺癌细胞A549周期分布的影响

通过流式细胞仪检测土贝母苷甲对人肺腺癌细胞A549周期分布的影响。实验结果表明: 1 ug/mL土贝母苷甲处理A549细胞48 h后比对照组A549细胞 G0/G1期百分率显著增加(P<0.05)。同时，处理组细胞的S期百分率比对照组A549细胞显著降低(P<0.05)。表明土贝母苷甲处理A549细胞48 h后，A549细胞更多的阻滞于G0/G1期，提示土贝母苷甲抑制人肺腺癌细胞增殖(图2)。

图2 土贝母苷甲对A549细胞周期分布的影响

三、土贝母苷甲对肺腺癌细胞A549凋亡水平的影响

通过流式细胞仪检测土贝母苷甲对人肺腺癌细胞A549凋亡水平的影响。实验结果表明：1 ug/mL土贝母苷甲处理A549细胞48 h后比对照组A549细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。表明土贝母苷甲处理A549细胞48 h后，A549细胞凋亡率显著增高，提示土贝母苷甲促进人肺腺癌细胞凋亡(图3)。

图3 土贝母苷甲对A549细胞凋亡率的影响

四、Western blot检测土贝母苷甲对Caspase通路蛋白表达差异

将细胞重新接种至60 mm细胞培养皿中，于37℃、5% CO2条件下培养至对数生长期，提取总蛋白，进行Western blot检测，以GAPDH作为内参，分析土贝母苷甲对A549细胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表达的影响。实验结果发现：处理组比对照组的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved Parp的表达显著增加(P<0.05)，表明土贝母苷甲可通过Caspase通路引起细胞凋亡(图4)。

图4 土贝母苷甲对A549细胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表达的影响

讨 论

近年来，中医药在肿瘤防治中以其确切的疗效倍受人们关注。肺癌位居癌症之首，但其治疗效果仍不理想。目前，肺癌仍然是全世界最常见的恶性肿瘤和最常见的癌症死亡原因，分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种主要组织学类型。非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型，其中腺癌占大多数[19]。研究发现土贝母苷甲在抗炎、抗病毒和免疫抑制效应等方面发挥着重要的生物作用[20]。此外，越来越多的证据表明土贝母苷甲具有显著的抗肿瘤作用，如抑制细胞增殖、阻滞细胞周期，促进人肝癌、食管鳞状细胞癌和绒毛膜癌等癌细胞凋亡[21-22]，在乳腺癌、结肠癌中也具有抑制肿瘤生长作用[23]。为了探索土贝母苷甲在治疗肺癌中的作用，我们选择人肺腺癌A549细胞作为研究对象，采用MTS法检测土贝母苷甲对A549细胞增殖的影响，随着土贝母苷甲浓度的增加，A549细胞的增殖能力显著降低，提示土贝母苷甲对A549细胞的增殖具有抑制作用。

通过诱导细胞周期停滞和凋亡来抑制肿瘤生长是肿瘤治疗的主要策略。因此，我们对土贝母苷甲处理A549细胞进行了细胞凋亡和细胞周期分析。凋亡诱导是阻碍肿瘤生长和增殖的主要机制之一。凋亡是细胞程序性死亡的过程，用于从体内去除不需要的细胞而不引起炎症。凋亡途径中的缺陷与肿瘤的发展有关，并且可能导致肿瘤对化疗的抗药性。我们通过流式细胞仪检测土贝母苷甲对人肺腺癌细胞A549凋亡水平的影响，发现土贝母苷甲处理A549细胞48 h后，A549细胞凋亡率显著增高。胱天蛋白酶在程序性细胞死亡的起始和执行中起关键作用，Caspase-3、 Caspase-9和Parp是细胞凋亡的主要执行者，负责结构和信号蛋白的蛋白水解降解，最终导致细胞死亡。为了进一步确定土贝母苷甲诱导的细胞活力降低是否与细胞凋亡相关，我们采用Western blot检测两组细胞中的Caspase-3、Caspase-9和Parp蛋白活性水平。我们发现土贝母苷甲处理A549细胞导致Caspase-3、Caspase-9和Parp活性水平显着增加，表明土贝母苷甲可通过Caspase通路引起细胞凋亡。

细胞周期停滞是抑制细胞增殖的重要信号。此外，凋亡的诱导可能通过细胞周期停滞来介导。为了确定土贝母苷甲是否由于诱导细胞周期停滞而抑制了癌细胞的生长，我们研究了土贝母苷甲对细胞周期进程的影响。使用流式细胞仪分析表明，土贝母苷甲处理A549细胞后G0/G1期细胞百分率显著增加，同时，S期细胞百分率显著降低。提示土贝母苷甲通过调节细胞周期抑制人肺腺癌细胞增殖。

以上研究已证实土贝母苷甲具有抗肿瘤作用，土贝母苷甲抑制人肺腺癌A549细胞增殖，并诱导A549细胞凋亡。发现土贝母苷甲处理A549细胞48 h后细胞增殖速度显著下降，并使用流式细胞仪检测发现土贝母苷甲处理A549细胞48 h后使细胞阻滞在G0/G1期，而抑制细胞增殖且促进细胞凋亡，Western blot 检测各组细胞发现土贝母苷甲可通过Caspase通路引起细胞凋亡。综上所述，土贝母苷甲在抑制肺腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡过程中起关键作用，为土贝母苷甲在后期不同病理类型的肺癌治疗提供理论依据，并为肺腺癌的治疗提供新的视野。