常见动物毒素及其检验方法在刑事技术鉴定中的应用

班智慧， 于孟娇， 付文波

(中央司法警官学院侦查学教研室， 河北 保定 071000)

毒物是指在一定条件下以较小剂量进入生物体后，发生生物化学作用，使生物体器官组织功能或形态结构发生损害甚至造成生物机体死亡的外源性化学物质[1]。毒物与药物之间没有截然的界限，盲目滥用可造成中毒甚至死亡。在我国，动物常被作为药用或食用，如蟾蜍、毒蛇经常被用于泡酒，过量食用可引发机体中毒。然而有毒动物毒素成分复杂，许多动物谱系独立地进化了毒液系统，且毒素属于天然有机成分，毒素结构不易检索；机体中毒后，体内毒素含量甚少，不易富集、提取；并且毒素进入体内，经消化液分解、与体内蛋白质结合等有机过程，毒素成分发生变化，毒性强度各不相同等这些因素都使得动物毒素的定性、定量检验困难重重。本文从常见动物毒素出发，对其各自的理化特性以及检验方法进行阐述，总结归纳当下常见动物毒素的检测方法，旨在为刑事科学技术工作人员提供检验参考。

1 常见动物毒素概述

1.1 蛇毒素

1.1.1 蛇毒素的理化特性 毒蛇的头部毒腺能够分泌毒液,大部分属于酶类，含有10多种酶类,如精氨酸酯酶、胶原蛋白酶等[2]。蛇毒素外观呈蛋清样黏稠液体，新鲜蛇毒呈微酸性、透明微黄色、有特殊腥味，含水量为65%～80%，具有广泛的生物学活性,含多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，经真空冰冻干燥处理后成为松脆易碎的半透明固体，干燥蛇毒可保存多年[3]。

1.1.2 蛇毒素的毒理作用 蛇毒中毒最常见的原因是被毒蛇意外咬伤引起，也有少数中毒是将蛇毒提纯后将纯品毒液通过肌内注射方式进行自杀或他杀引起的。各种蛇毒所含成分不同，其作用于机体出现的中毒症状也不同。蛇咬伤中毒主要以脑、心、肺、肝、肾、淋巴结等组织器官损害较重[4]，血液和循环系统的损害表现症状如心力衰竭、心律失常、出血性休克等；神经系统的损害症状表现为骨骼肌运动麻痹乃至外周呼吸麻痹；实验室检查可表现出肝肾功能、心肌酶谱、电解质和凝血结果异常[5]。

1.2 河豚(河鲀)毒素

1.2.1 河豚毒素的理化特性 河豚毒素是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，240 ℃开始碳化，但300 ℃以上也不分解。微溶于水，易溶于稀乙醇，微溶于水和乙醇，不溶于油脂和脂溶性有机溶剂，粗制品为棕黄色粉末，精制品为白色无定形粉末。河豚毒素是一种天然剧毒毒素，是一种非蛋白的强神经毒，对生物碱类试剂不发生任何沉淀与颜色反应。河豚毒素分子式为C11H17N3O8，其分子结构见图1。

图1 河豚毒素分子结构

1.2.2 河豚毒素的毒理作用 河豚中毒多因误食引起，食用者或者不了解河豚含有剧毒，误食内脏或不新鲜的鱼肉，或者食用处理、烹饪方法不得当而引起中毒。河豚毒素主要通过麻痹神经中枢和神经末梢，血液中胆碱酯酶被抑制，神经肌肉系统被严重麻痹，阻止神经肌肉传导，进而引起中枢神经失调。中毒者首先发生胃部不适，随后逐渐出现全身不适，最后因呼吸中枢麻痹或房室传导阻滞而死亡。

1.3 斑蝥素

1.3.1 斑蝥素的理化特性 斑蝥素，亦称为斑蝥酸酐，为节肢动物斑蝥体内的主要毒性物质。斑蝥素无色、有光泽、斜方形小片结晶，微溶于乙醇、热水，能溶于丙酮及油脂，但不溶于冷水。斑蝥素遇稀碱生成盐，其溶液再调成酸性，则又析出斑蝥素[6]。斑蝥素的分子式为C10H12O4，其化学结构见图2。

图2 斑蝥素的化学结构

1.3.2 斑蝥素的毒理作用 出现斑蝥中毒或因为错误用于堕胎、治疗月经不调引起，或误作偏方治疗肺脓肿引起消化道出血引起。斑蝥素中毒会引发口腔及咽喉有烧灼感、疼痛，口腔黏膜出现水泡或溃疡等消化道症状；或者会发生尿频、尿道烧灼感、血尿等生殖器官炎症。严重者可出现头晕、头痛、腹痛、心跳加快、肢端发绀、口唇青紫等神经系统和循环系统症状，最终昏迷而死。中毒到死亡时间较快，快则30 min，慢则1～3 h死亡。

2 常见动物毒素检验方法

在刑事技术鉴定中，毒物物证多为生物检材，如血液、肝、肾、尿、胃内容物等。这就要求在进行相关检测时，首先要将毒素或其代谢物从血液、肝脏、尿液等检材中提取出来，并进行净化，才能进行检测。检材的提取通常采用溶剂溶解法、液-液萃取法或者固相微萃取法进行提取。本部分阐述的检测方法是通过文献检索方式，搜集的动物体内毒素检测的方法，对于人体中或者尸体中检材含量的定性定量分析，参照此方法进行。

2.1 蛇毒素的检验方法

2.1.1 法医毒理学检验 根据蛇咬伤的症状进行初步检验，一般都会在身体暴露部位出现毒蛇牙痕，并且被咬伤口周围组织高度肿胀、麻木坏死，并迅速扩展到周围组织。中毒死亡者可根据尸检结果判断，若出现肿胀组织下有淡红色水肿液渗出，皮下出血明显，并且局部淋巴结肿大等症状则可能是毒蛇咬伤中毒致死。

2.1.2 生物学检验方法 双向免疫扩散法：用pH值为8.6的巴比妥钠缓冲液配制质量浓度1%的琼脂糖凝胶，厚度2～3 mm，自然冷却后打孔，孔距10 mm，在火焰上缓缓加热以封底，中心孔加抗银环蛇血清，周围加蛇毒及检材抗原，每孔均加液量15 mL，置于37 ℃水浴箱24～48 h，观察结果。标准阳性血清和检材抗原之间出现白色沉淀线者为阳性，不出现沉淀线者为阴性。本方法适用于毒素含量较高的检材初检，如伤口附近提取的血液检材。

2.2 河豚毒素的检验方法 河豚毒素的提取方法主要包括乙酸提取法、改良乙酸提取法、树脂提取法、甲醇提取法等。检测方法主要有小鼠生物法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。

2.2.1 小鼠生物法 小鼠生物法(以30 min内将一体质量20 g小鼠致死所用河豚毒素的量为一鼠单位)是最常用、最直观的检测方法，通过小鼠死亡前所呈现出的典型的河豚毒素中毒症状，将河豚毒素与其他致死性物质区分开。其原理是，一定体质量的小鼠经腹腔注射河豚毒素后，其死亡时间的倒数与注射河豚毒素剂量之间存在着线性关系，由此可根据小鼠死亡时间推断河豚毒素的含量。但实际使用时因个体差异大、重现性较差，对于精确定量具有很大的局限性。

2.2.2 胶体金免疫层析法 深圳市计量质量检测研究院张世伟等[7]建立了河豚毒素的胶体金免疫层析检测方法，主要用于河豚毒素快速定性检测，其所建立的河豚毒素检测方法IC50为48 ng·mL-1,线性范围为(10～160) μg·L-1(y=-0.20lnx+1.23,R2=0.98)[7]。另有林壮森等[8]应用小鼠生物实验和间接竞争抑制酶联免疫吸附实验的方法同步测量河豚毒素含量。

2.2.3 高效液相色谱—质谱法 骆和东等[9]建立了液相色谱-质谱法测定织纹螺中河豚毒素的分析方法。其将螺肉中可食用部分进行匀质，用0.03 mmol·L-1乙酸溶液提取,水浴加热10 min,用Sep-Pak C18固相萃取柱净化,再用截留相对分子质量为3 000的超滤管过滤。采用Insertsil ODS-3色谱柱分离,以含有30 mmol·L-1七氟丁酸的甲酸铵溶液 (1 mmol·L-1) -甲醇 (体积比为99∶1) 为流动相,采用电喷雾离子源,选择离子监测模式检测。以保留时间和河豚毒素的二级质谱特征碎片离子予以定性确证。结果表明,在此分析条件下,可将河豚毒素及其衍生物分离,在0.01～10.00 mg·L-1范围内线性关系良好 (r2>0.995),检出限 (以3倍信噪比为计) 为2 μg·L-1。

2.3 斑蝥素检验方法 斑蝥药材中斑蝥素的提取工艺主要包括有碱水法、酸水解法、超声波提取法和热回流法。斑蝥素中毒样品处理时，参考斑蝥药材提取工艺，采用低浓度氢氧化钠溶液煎煮处理或超声波提取方法。酸水解法提取样品中的斑蝥素时，加入适量丙酮、三氯甲烷及数滴浓盐酸，沸腾回流后，将提取液浓缩。斑蝥素及其衍生物的分析方法主要包括法医毒理学方法、薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法等。

2.3.1 法医毒理学方法 斑蝥素中毒可以引发强烈的消化道症状、泌尿系统症状。根据中毒者所出现的中毒症状是否符合斑蝥素中毒症状进行初步判断，若是中毒死亡者则可以根据尸体检查情况进行判断。

2.3.2 化学检验法 本方法主要为微量升华结晶和斑蝥酸钡结晶试验，适用于斑蝥虫样本中斑蝥素含量的测定。用吸管吸取1 mg·mL-1斑蝥素乙酸乙酯液，滴1滴在凹穴载玻片的凹穴中，挥干溶剂后，用一洁净的平面载玻片盖上，顶部覆盖一片湿润的滤纸，用试管夹夹住两片载玻片，底部用小火加热片刻，冷却后，将上面的载玻片翻转后置显微镜下，观察斑蝥素升华物的透明棒状或棱柱状结晶形态，然后在升华物上加1 mol·L-1Ba(OH)2溶液一滴，用盖玻片覆盖液体，再置显微镜下观察生成的斑蝥酸钡束状针晶簇，另吸取斑蝥虫样本液，重复上述操作，观察升华物和Ba(OH)2反应物的形态，并与已知斑蝥素的形态进行对比[10]。

2.3.3 气相色谱法 斑蝥素为内酸酐化合物，遇碱可开环成盐而溶于水，酸化后又可闭环重新转变成斑蝥素，利用此性质可对样品进行净化处理；斑蝥素分子较小，易气化，适合用气象色谱法和气质联用法进行鉴定。适用于生物检材，如胃内容物、血液中的斑蝥素成分的分析。

在确定的色谱条件下，分别吸取斑蝥虫提取样液和生物检材提取样液进行进样测定，记录色谱图并与已知斑蝥素样本进行对比，如果检材色谱图中出现与已知斑蝥素样本保留时间相同或相近的色谱峰，调整色谱条件，使斑蝥素的保留时间适当延长，再次进样对比，根据保留时间对比结果判断检材中是否含有斑蝥素。有些生物毒素的制备方法除了从来源物中提取之外，还可以进行人工合成[11]。

3 讨论

有毒动物利用多肽毒素进行捕食和防御，表现出惊人的分子多样性，其分子多样性至今仍然是各国学者正在深入探究的热门科学问题[12]。本文通过对常见动物毒素，蛇毒素、河豚毒素、斑蝥素的理化特性和毒理作用分析，采用文献检索的方法，对目前相关毒素的实验室检测方法进行总结归纳，希望可以为刑事科学技术人员解决毒素检验效率低和准确率的问题提供帮助。但是在实验室的实验样本中，样本毒素含量较高，且毒素提取时间及时，测定结果相对较好，然而，在实际案件中，毒物检材多为血液、肝、肾、尿、胃内容物等，毒素含量较低，再加上提取不及时、消化液的分解、毒素与体内蛋白质的结合等因素的影响，毒素成分会发生相应的变化，以上方法可以作为参考，在实际案件处理中需要更加精确的分析仪器，更先进的检材提取方法。