LINC00665通过miR-146a-5p对肺癌A549细胞增殖的影响*

刘 华, 王华启， 马云云

(1.郑州大学基础医学院形态学中心，郑州450001；2.郑州大学第一附属医院呼吸内科，郑州 450052；3.河南医学高等专科学校，郑州451191)

肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一[1-2]。根据临床病理类型的不同，肺癌可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两种类型。其中NSCLC是肺癌的主要类型，约占肺癌患者的85%。由于缺乏早期临床表现，当患者出现明显临床症状时，肿瘤细胞通常已发生淋巴转移和远处转移，预后较差[3-4]。因此，探索NSCLC发生发展过程，明晰其发病机制，寻找更好的早期标志物和治疗靶点对NSCLC防治具有重要意义。

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是指不编码蛋白质的RNA，可在RNA加工、转录和翻译水平调控基因表达。ncRNA包括长链非编码RNA(long non-cording RNA，lncRNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)等[5]。其中lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的ncRNA，可通过影响启动子转录，影响RNA转录、剪切、降解、翻译等多种方式调控基因的表达[6-8]。miRNA主要以完全或不完全互补结合方式与其靶基因mRNA的3′非翻译区相互作用，在转录或翻译水平调控基因表达，进而影响细胞生长、发育、分化、增殖、凋亡和细胞周期[9]。竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)机制是目前公认的lncRNA调控机制[5]。该机制认为lncRNA可以竞争性结合miRNA，通过对miRNA负向调控对其靶基因起抑制作用，进而参与多种信号通路及生物学功能调控。

大量研究[2,10-11]已证实，lncRNAs参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成等多种病理过程，其异常表达与多种肿瘤发生有关。最近研究[12-15]发现，LINC00665在胃癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤的发展中起重要调控作用，但其在NSCLC中的表达及生物调控作用尚不清楚。生物信息学分析表明lncRNA与miR-146a-5p存在相互结合位点。本课题组在前期研究基础上，通过检测LINC00665和miR-146a-5p在NSCLC组织中的表达情况，分析LINC00665抑制或miR-146a-5p过表达对A549细胞生物学功能的影响，探索LINC00665和miR-146a-5p在NSCLC发生和发展的作用机制。

1 对象与方法

1.1 材料 选取2017年2月—2018年12月在郑州大学第一附属医院确诊的NSCLC患者手术切除组织和相应的癌旁正常肺组织(距离肿瘤组织≥5 cm)各37例。其中男25例，年龄30～79(59.15±6.18)岁，女12例，年龄35～70(62.23±4.92)岁。纳入标准：①经病理组织学检查确诊为NSCLC。②手术前均未接受过放疗和化疗。③根据肺癌TNM分期(第8版)[16-17]对其临床病理信息进行分类，包括Ⅰ/Ⅱ期23例和Ⅲ期14例。组织标本收集后立即液氮保存。本研究得到郑州大学伦理委员会的批准，并与所有患者签订知情同意书。

1.2 仪器与试剂 肺癌A549细胞株、人胚肾293T细胞株购自上海中科院细胞库；胎牛血清、DMEM高糖培养液购自Gibco公司；CCK8试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；miRNA提取试剂盒、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(SYBR Green PCR Master Mix)、脂质体LipofectamineTM2000购自Thermo Fisher Scientific公司；pmirGLO、双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；PCR引物、LINC00665 siRNA及siRNA对照(si-NC)、miR-146a-5p mimics、miR-146a-5p Inhibitor和miRNA对照(miR-NC)由上海生工生物工程公司合成；RT-qPCR仪(ABI7500)购自美国Applied Biosystems公司；化学发光仪购自德国Berthold公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪(AccuriC6)购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染 A549细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃体积分数5% CO2培养箱中培养。细胞分为3组：①空白对照组：不进行任何处理。②对照组：转染siR-NC或miR-NC。③实验组：转染LINC00665 siRNA或miR-146a-5p mimics/miR-146a-5p Inhibitor。转染按照LipofectamineTM2000试剂盒说明进行，转染48 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.3.2 RT-qPCR 提取组织样本及A549细胞的总RNA后逆转录，以cDNA为模板进行RT-qPCR。引物序列：LINC00665上游5′-CTTTATGCACAAACTTCACA-3′，下游5′-TTTTAGCCT GAAAGTAGCC-3′；GAPDH上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游5′-GGGGTC GTTGATGGCAACA-3′；miR-146a-5p上游5′- GGGGTGAGAACTGAATTCCAT-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以GAPDH为内参基因，采用2-△△Ct法分析结果数据。

1.3.3 CCK8增殖实验 以每孔2×103个细胞将各组A549细胞铺于96孔板中，分别在培养24、48、72 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，孵育2 h后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。每组设置3个复孔。

1.3.4 细胞周期检测 收集每组A549细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，质量分数90%乙醇预冷，4 ℃固定24 h，PBS洗涤后取450 μL细胞悬液，加入100 mg·L-1的RNase 2 μL， 37 ℃孵育10 min后，加PI 500 μL，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.3.5 双荧光素酶实验 PCR扩增包含miR-146a-5p结合位点的LINC00665序列片段(野生型和突变型)，克隆入报告基因载体(pmirGLO-Wt-LINC00665/pmirGLO-Mt-LINC00665)后，与miR-146a-5p mimics/miR-NC共转染293T细胞，48 h后按照试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 LINC00665和miR-146a-5p在NSCLC组织中的表达比较 癌组织中LINC00665相对表达量高于相应癌旁组织，而癌组织中miR-146a-5p相对表达量低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.001)。TNM Ⅲ期癌组织中LINC00665相对表达量高于TNM Ⅰ/Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)。TNM分期2组miR-146a-5p相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1-2。

表1 NSCLC组织中LINC00665和miR-146a-5p的相对表达量比较

表2 不同TNM分期中LINC00665、miR-146a-5p相对表达量比较

2.2 抑制LINC00665对组细胞增殖和细胞周期的影响 CCK8实验结果显示，实验组细胞在培养24、48、72 h时的吸光度A值均低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果显示，实验组G0/G1期细胞比率较空白对照组和对照组升高，而G2/M期细胞比率则降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3-4。

表3 3组细胞CCK8增殖结果A值比较

表4 3组细胞周期分布比较

2.3 双荧光素酶检测结果以及LINC00665抑制对miR-146a-5p的影响 生物信息学分析(LncBase v.2)显示，LINC00665与miR-146a-5p存在吸附结合位点(图1A)。双荧光素酶报告基因实验结果说明，LINC00665可以通过预测的吸附位点与结合miR-146a-5p。见表5。A549细胞中，RT-qPCR检测miR-146a-5p和LINC00665表达结果中，实验组细胞的miR-146a-5p和LINC00665表达水平较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。对37例NSCLC癌组织中LINC00665与miR-146a-5p表达量的相关性分析结果显示，二者呈现负相关(r=-0.572，P<0.05)(图1B)。

A: LINC00665与miR-146a-5p存在吸附结合位点；B：37例NSCLC组织中LINC00665与miR-146a-5p表达的相关性

表5 双荧光素酶活性检测结果比较

表6 RT-qPCR检测3组细胞中LINC00665、miR-146a-5p表达结果比较

2.4 过表达miR-146a-5p对细胞增殖和细胞周期的影响 CCK8结果显示，实验组细胞在24、48、72 h时的吸光度A值均低于空白对照组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。流式细胞术结果显示，实验组G0/G1期细胞比率较空白对照组和对照组升高，而G2/M期细胞比率则降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表8。

2.5 抑制miR-146a-5p对细胞增殖的影响 CCK8结果显示，LINC00665 siRNA + miR-146a-5p Inhibitor组细胞在24、48、72 h时的吸光度A值均高于LINC00665 siRNA组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表9。

表7 3组细胞CCK8增殖结果A值比较

表8 3组细胞周期分布比较

表9 3组细胞CCK8增殖结果A值比较

3 讨论

本研究结果显示，LINC00665在癌组织中呈现异常高表达，表达水平与NSCLC的TNM分期相关，提示LINC00665在NSCLC的诊断中具有潜在的分子标志物的价值，值得进一步深入研究。在A549细胞中沉默LINC00665表达可以显著抑制细胞增殖、使细胞发生G0/G1期阻滞，表明LINC00665参与肺癌细胞增殖的调控。lncRNA通过海绵体吸附miRNA发挥调控作用是lncRNA的主要机制之一[6]。本研究通过生物信息学分析，预测到LINC00665与miR-146a-5p具有8个碱基吸附位点，进一步的双荧光素酶报告基因实验证实了LINC00665与miR-146a-5p能发生相互作用；又通过RT-qPCR检测LINC00665抑制对细胞miR-146a-5p表达水平的影响，结果显示在A549细胞中，抑制LINC00665表达可导致miR-146a-5p表达水平显著升高，呈负调控作用；对37例NSCLC癌组织中LINC00665与miR-146a-5p表达量的相关性分析显示，LINC00665表达与miR-146a-5p表达呈显著负相关关系。以上结果均提示LINC00665可与miR-146a-5p相互作用，对其发挥负相调作用。为验证该发现，本课题组又在A549细胞中过表达miR-146a-5p实验，结果与抑制LINC00665后的检测结果一致，进一步证实LINC00665通过海绵体吸附作用，负调控miR-146a-5p表达，参与肺癌细胞增殖的调控。

越来越多的研究[18-20]表明，miRNAs参与肿瘤的发生发展过程。miR-146a-5p的异常表达在多种肿瘤中被广泛发现，如肝癌、胃癌、肺癌等。除扮演抑癌基因的角色外，还有研究[21-22]显示，miR-146a-5p表达水平与生存期相关，表达水平越低生存期越短，提示miR-146a-5p可能成为NSCLC生存判断的潜在标志物。ceRNA假设认为，lncRNA作为ncRNA的一种，可以竞争结合内源性miRNA，阻断miRNA与其下游靶基因的相互作用，通过间接调控靶基因mRNA的表达，发挥生物学作用[5]。一个miRNA可以有多个靶基因，不同组织细胞中靶基因可以不同。miR-146a-5p的靶基因包括CCND1、CCND2、RNA结合蛋白HuR、EGFR等，参与了肿瘤细胞增殖机制和细胞周期调控过程[21-22]。因此，miR-146a-5p的肿瘤抑制作用机制，也受到特定lncRNA调控。结合本实验结果推测，LINC00665通过吸附负调控miR-146a-5p表达，miR-146a-5p可能通过作用于CCND1、CCND2、HuR、EGFR等靶基因，参与肺癌细胞增殖的调控。

综上所述，本研究结果发现LINC00665在癌组织中呈现异常高表达，与TNM分期相关；其可通过海绵体吸附miR-146a-5p，抑制细胞增殖、使细胞发生G0/G1期阻滞；LINC00665-miR-146a-5p调节轴参与了肺癌细胞增殖调控机制，但是其下游靶基因及信号通路仍需进一步研究证实。