吞噬细胞与多发性硬化相关性的研究进展

周晓钰 宋传旺 桑道乾△

1）蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠233000 2）蚌埠医学院医学检验学院免疫教研室，安徽 蚌埠233030

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是好发于年轻女性的免疫介导性的与中枢神经系统有关的慢性炎性脱髓鞘疾病，是发生在年轻人神经系统疾病中非创伤性致残率最高的疾病［1-3］。MS 在全世界人口中约有250万发病人群［1］，其中女性发病是男性的2～3倍［2］。MS的病因的尚不清楚，主要与遗传因素、环境因素有关。MS的发病机制至今也尚不明确，但已知的是在MS 中枢神经系统的病灶存在大量免疫细胞浸润。早期大量研究表明，CD4+辅助T细胞［CD4+T-helper（TH）cells］是MS 发病机制中主要的驱动细胞，其中以TH1/TH17 细胞为主。然而，目前的研究显示CD8+T 细胞、B 细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞（NK cell）、树突状细胞（DC cell）等在MS发病中也起着重要的作用［4-9］。吞噬细胞作为固有免疫系统的重要组成部分，近年来备受关注，成为研究MS 的热点之一。另外，在活性的MS 病灶中，巨噬细胞和小胶质细胞是占免疫细胞中的比例最多［10］。目前研究显示，在MS、MS 的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）最初开始的发病阶段中，外周血来源的巨噬细胞会浸润到中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，与中枢神经系统驻留吞噬细胞（CNS-resident phagocytic cells）共同促进了MS 的发展。此外，目前了解到吞噬细胞是极度异质性的细胞群，既具有致炎作用又有抗炎功能［11-12］。在MS的发展过程中，活化的吞噬细胞可以释放多种促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23 等，促进炎症的发生发展，同时也可以释放多种抗炎因子、神经营养因子，如IL-10、IL-13、TGF-β、IGF-1、BDNF等，有利于疾病后期的髓鞘再生、组织恢复。吞噬细胞参与了MS的发展、修复，且吞噬细胞的种类繁多，在疾病不同阶段呈现的主要表型不同，并释放大量物质，因此有必要深入了解吞噬细胞与多发性硬化的相关性。

本文重点分析、归纳近年来国内外吞噬细胞与MS之间的相关性研究，以及以吞噬细胞为靶向治疗的相关报道，旨在为今后MS治疗提供指导意义。

1 MS和EAE

MS 的病理特征是患者大脑和脊髓的灰质和白质局灶性病变，表现为髓鞘和少突胶质细胞的大量丧失。正因为这种病变分布的存在，不同MS患者的临床表现体现出异质性，且常表现为感觉和视觉异常、运动、认知功能的损害以及疼痛和疲劳等。同样，MS 是具有不同临床阶段的复杂的异质性疾病，MS 的临床分型也呈现出多样性。其主要表现为两种表型：（1）复发缓解型MS（relasping remitting multiple sclerosis，RRMS）：最主要的表现形式，占MS患者的80%～85%，存在复发和缓解过程，且很少会留下后遗症。但此型部分RRMS患者（约50%）在10～15 a 发展为继发进展型MS（secondary progressive multiple sclerosis，SPMS），此过程中疾病可能会加重，且此疾病类型发病机制中，与神经变性、进展性的残疾有关的小胶质细胞活化占主导。（2）原发进展型MS（primary progressive multiple sclerosis，PPMS）：约10% MS患者表现为疾病隐形发作和疾病稳定发展，无复发缓解过程［13-14］。

由于MS 的异质性，目前对MS 的认识仍不足。为了更好地研究MS，RIVERS 等［15］在1933 年利用小鼠构建了MS 的动物模型——EAE。目前研究表明EAE 可以通过在完整的弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant）中直接免疫髓磷脂抗原髓磷脂蛋白脂蛋白（myelin proteolipid protein，PLP）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）诱导［16］，或将分离的活化的CD4+T细胞转移至幼稚动物体内诱导［17］，也可将CD8+T 细胞导入幼稚动物体内诱导［17］。EAE 以T 细胞和巨噬细胞的浸润、神经炎症和严重的脱髓鞘为特征，是目前最好的研究MS的模型［18］。但MS 的病理机制是原发性的脱髓鞘和轴突保留的融合斑块，而诱导EAE 的损伤却显示出广泛的轴突损伤和继发性脱髓鞘的破坏，所以EAE 并不能完全代替MS。除EAE外，常使用的实验模型有病毒引起的慢性脱髓鞘疾病与毒素引起的脱髓鞘，如铜酮［19］。这些模型以多种方式使我们了解了吞噬细胞在MS发病机制中的作用。

2 CNS中吞噬细胞

吞噬细胞即具有吞噬作用的细胞。总的来说，吞噬细胞分为两大类，即大吞噬细胞（单核巨噬细胞系统）、小吞噬细胞（中性粒细胞）。吞噬细胞面对感染刺激的反应包括趋化、识别、吞噬、杀灭和降解。

2.1 吞噬细胞的起源 关于CNS中吞噬细胞的起源一直存在争议。既往研究普遍认为单核巨噬细胞系统的每个细胞（即单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞等）仅来自骨髓中的造血干细胞，而由造血干细胞分化而来的单核细胞被认为是常见的单核巨噬细胞系统前体，其可不断补充包括大脑和脊髓在内的全身巨噬细胞。近年来研究表明，驻留巨噬细胞的起源为在胚胎发生的早期由卵黄囊中的红系髓样前体（erythro-myeloid precursors，EMP）发育并分化而来［20］。GOLDMANN等［21］发现CNS巨噬细胞除脉络丛巨噬细胞（cpMø）外仅起源于EMP，cpMø主要是出生后由骨髓来源的Ly6chi单核细胞分化而来。另有研究显示EMP 会在胚胎发育的第7.5～8.0 天快速分化为CD45+CX3CR1loF4/80lo 细胞（即A1 细胞），但A1细胞不成熟，约在胚胎发育的第9 天分化为CD45+CX3CR1hiF4/80hi 细胞（即A2 细胞），最终A2 细胞进入神经组织，并分化成小胶质细胞、脑膜巨噬细胞（meningeal macrophages，mMø）、脉络丛巨噬细胞（choroid-plexus macrophages，cpMø）、血管周巨噬细胞（perivascular macrophages，pvMø）［22］。一旦进入神经组织后，这些细胞就可以长期存在且可以不断自我更新，这种自我更新是通过细胞增殖和凋亡的时间与空间上联合的形式，同时在一生中允许这些细胞群可以自我更新多次。

2.2 CNS 中吞噬细胞的分类 在MS 病变发展过程中CNS中的吞噬细胞分为：（1）外周血单核细胞来源的巨噬细胞；（2）中枢神经系统驻留吞噬细胞，其中包括小胶质细胞、非实质巨噬细胞，非实质巨噬细胞又包括mMø、cpMø、pvMø［23］。正常状态下驻留巨噬细胞可以维持CNS处于动态平衡，当MS疾病发生时CNS 的动态平衡被打破，募集而来的外周血单核细胞会浸润到CNS，并引起小胶质细胞的激活，同时小胶质细胞和募集而来的外周血单核细胞会吞噬并积聚大量髓磷脂来源的脂质，在MS的病灶中形成大量的泡沫巨噬细胞（foamy macrophages）。

吞噬细胞的种类繁多，但在MS病变中枢神经系统出现“动荡”的情况下，主要起作用的是小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞，下文中将把重点放在这两种细胞上，关于非实质巨噬细胞在脑膜、血管周、脉络丛的作用机制仍需进一步研究。

3 小胶质细胞和巨噬细胞的极化

在MS和EAE中，小胶质细胞和巨噬细胞在面对不同的刺激信号时可以转化成不同的表型，此过程称为极化。目前主要将其分为两大功能表型：M1型和M2型。

3.1 M1 型 M1 型又称“经典活化”型（classically activated macrophages，M1）、促炎表型［24］。在EAE 中髓鞘反应性T 细胞产生的GM-CSF、IFNγ和TNFα可诱导M1 促炎表型的产生，另外体外用脂多糖（LPS）也可促使产生M1表型。激活的M1表型可释放大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23，趋化因子及受体，如CCL2-CCL5、CCL8、CCL12、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL1、CXCL3、CXCL8-CXCL13、CCR3、CXCR1、CXCR3等，以及蛋白酶、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等［12，25-28］。体内外研究表明，释放的这些物质对CNS的少突胶质细胞和神经元的增殖有害，并会导致炎症微环境的形成，在这种环境下促进髓鞘的破坏和周围细胞的损伤［26-27］，其中TNF是活化的M1 型细胞产生的主要的促炎物质，主要与脱髓鞘的发病机制有关［29］。将TNF 导入小鼠脊髓培养物中时，会导致少突胶质细胞的死亡和髓磷脂损伤，从而促进脱髓鞘的产生和组织损伤［29-30］。另外，一旦M1 型细胞被激活，M1 型细胞形态会发生改变，由静息状态的高度分枝状变成活化态的分支少的阿米巴样形式［28］，并在其表面会表达高水平的MHCII分子、CD86分子和CD40 分子，起到抗原提呈的作用，从而促进T 细胞的不断激活以及募集至CNS。

3.2 M2型 M2 型又称“替代活化”型（alternatively activated mac-rophages，M2）、抗炎表型［24］。M2 表型在体外可被IL-4/IL-13和IL-10等诱导。M2型的吞噬细胞可以产生抗炎因子，如IL-10、IL-13、IL-33和TGF-β，脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养因子，如胰岛素样生长因子-1（IGF-1），血管内皮细胞生长因子，表皮生长因子和IL-1受体拮抗剂等［31-35］。另外，M2 型细胞还可以阻断iNOS，从而减轻炎症的发生；同时，在M2 型细胞表面常高度表达精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）、甘露糖受体（mannose receptor）、几丁质酶样（chitinaselike Ym1）及CD14、CD163、CD204、CD206、CCL17、CCL22 和CCL24 等受体［12，25，31，36-39］。M2型细胞主要促进组织的修复、再生和少突胶质细胞的分化［25］，也有助于寄生虫的清除［31］。

值得注意的是，M1 型和M2 型细胞并不是各自仅在MS病变的早期和后期出现。M2型细胞早在早期阶段就已存在，且到后期达到峰值［40］。根据体内细胞因子的环境变化，如iNOS 和Arg-1 的同时存在（iNOS催化Arg-1成为促炎介质，而Arg-1与iNOS作用相反，其催化Arg-1成为抗炎介质），提示这两型细胞在疾病发展过程中共存于炎性组织中［40］。最近的证据表明，仅将吞噬细胞分为M1、M2型太过于简单，其仅代表两个极端激活的状态［28，41］。吞噬细胞既具有高度异质性又有极强的可塑性，其活化态并不是始终固定在某一种极化态，而是处于不断的动态变化中，M1和M2表型之间的动态平衡可能决定着MS和EAE的疾病进程。近年来，根据M2型细胞受到的刺激不同进一步将其细分为3 种主要类型：M2a、M2b、M2c，也有报道提出M1/M2混合表型的存在［42］。M2a型是被IL-4、IL-13所诱导，且能诱导T细胞产生大量的IL-4、IL-13［25］，在其表面表达高水平CD206、FIZZ1、Arg-1、YM1，主要起到组织修复、清除寄生虫、形成胶原蛋白的作用。M2b型吞噬细胞由IL-1R配体或免疫复合物激活，表面常表达高水平的MHC-II、CD86，可募集调节性T细胞。M2c型吞噬细胞可被糖皮质激素、IL-10、TGF-β1 激活，可表达CD163，有利于伤口的愈合［43］。

吞噬细胞既具有高度异质性又具有很强的可塑性，吞噬细胞呈现的表型多样性促进吞噬细胞在不同环境下发挥特定的功能。尽管M1/M2这种分法存在争议，但目前M1/M2 二分法仍是公认的用于描述CNS 中吞噬细胞表型的主要模型，可以通过观察MS 患者在急性期和缓解期的M1/M2 吞噬细胞是否平衡，进而探讨M1/M2 吞噬细胞水平与疾病严重程度的关系，对未来MS的治疗有指导意义。

4 吞噬细胞与MS

MS的主要病理学基础为炎症反应、髓鞘脱失而轴索相对保留、反应性神经胶质增生、髓鞘再生。如前文介绍，存在很多免疫细胞参与MS 的免疫应答，主要的驱动细胞有CD4+TH17细胞，其以分泌IL-17为主要特征，而IL-17 是一种炎症前细胞因子，可促进局部炎症的进展和扩大，是促进MS发生发展过程中的重要细胞因子；同时TH17 细胞也分泌IL-6、IL-21、IL-23等细胞因子，这些细胞因子破坏神经内皮细胞间的紧密连接、破坏血脑屏障。CD8+T 细胞也可分泌IL-17，也可通过分泌一些趋化因子吸引CD4+T细胞，从而参与MS的发展。B细胞活化产生的IgG寡克隆带在95%的患者脑脊液中可被发现，以及活化的B 细胞也可分泌多种细胞因子参与MS，如促炎因子IL-6、IL-17A、IL-12、LT-α和TNF-α12 以及抗炎因子IL-10 和TGF-β等。研究表明树突状细胞是被认为是诱发EAE发病的唯一的抗原提呈细胞（APC），对CD4+T 细胞的分化起到决定性作用。由此可见，参与MS的这些免疫细胞中，大多涉及到MS的炎症反应过程，而脱髓鞘、髓鞘再生却无法完全用上述细胞解释，大量证据表明与吞噬细胞的参与有关。

4.1 吞噬细胞与脱髓鞘 在急性MS 的脱髓鞘病灶内细胞可以看到大量的吞噬细胞浸润，主要为外周血来源的巨噬细胞，提示MS的脱髓鞘过程有吞噬细胞的参与。吞噬细胞作为固有免疫细胞可发挥抗原提呈作用，实验表明，在EAE 发病早期时，吞噬细胞表达的MHCⅡ类分子、共刺激分子显著上调，而MHCⅡ类分子与共刺激分子是APC发挥抗原提呈给CD4+T 细胞的两个重要的信号，引起CD4+T 细胞的活化。另外，吞噬细胞表面的MHCⅠ类分子也被发现表达上调，可通过抗原提呈作用传递给CD8+T 细胞。CD4+T 和CD8+T 细胞的募集、活化可分泌大量的促炎因子、趋化因子等，形成炎症级联，进而导致髓鞘损伤。同时，髓鞘反应性T细胞可以促进M1型吞噬细胞的活化，进而也产生大量的促炎因子。因此，吞噬细胞和T细胞可以相互活化，形成炎症级联，促进TNF-α和IFN-γ的分泌，从而直接造成少突胶质细胞（OL）的损伤，从而造成脱髓鞘。还有研究显示，小胶质细胞可通过改变能量代谢方式引起一系列氧化应激产物的聚集，进而全面损伤CNS 内的细胞，损伤OL和少突胶质前体细胞（OPC），也是造成脱髓鞘的重要原因之一；M1型吞噬细胞分泌大量的趋化因子也诱导了EAE 的发作。值得注意的是，小胶质细胞的活化、增殖常在MS 病变发作前就已开始。研究表明，在活化前病灶中可以检测到TMEM119和P2RY12（TMEM119 和P2RY12 是特异性的小胶质细胞标记物）的免疫反应性［3］。也有研究显示小胶质细胞的耗竭或小胶质细胞基因的下调都会导致EAE疾病严重性的降低和脱髓鞘减少。还有研究利用串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）证实了单核细胞来源的巨噬细胞在郎飞结的节点上引起脱髓鞘反应［44］。

4.2 吞噬细胞与髓鞘再生 小胶质细胞激活后细胞表面表达TREM2 受体、补体受体3 和信号调节蛋白-α，会引起小胶质细胞吞噬病变中的髓磷脂碎片［45］，通过抗体阻断TREM2后发现EAE小鼠病情加重。清除髓磷脂是髓鞘再生过程中的关键步骤，才能使少突胶质前体细胞募集进入病变区域并随后分化［46-47］。值得注意的是，小胶质细胞吞噬髓磷脂碎片的能力比巨噬细胞强。M2 型吞噬细胞可分泌很多神经营养因子，其中IGF-1被发现可存在于脱髓鞘部位，体外研究显示其可促OPC 分化，从而达到髓鞘再生的作用。也有实验表明，通过缓慢注射IGF-1 可增强大鼠溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘模型的髓鞘再生。吞噬细胞分泌一些抗炎因子（如IL-10）甚至促炎因子（如TNF-α、IFN-γ），被证明具有保护髓鞘的功能。在EAE 的后期，随着M2 型吞噬细胞的增加，其可以促进星形胶质细胞增生，从而促进髓鞘再生。

5 吞噬细胞与MS的治疗

MS是目前仍无法完全治愈的疾病，经过数年的努力，目前已经批准了超过10 种药物用于MS 的治疗，这些药物具有免疫调节作用，可以降低RRMS患者的复发率［48］，但无证据表明其对CNS 有直接影响［48］。以往对这些治疗方法作用机制的研究多聚焦于通过改变T 细胞的应答［干扰素-β（interferon-β，IFNβ）、醋酸格拉替雷（glatiramer Acetate，GA）、富马酸二甲酯（dimethyl Fumarate，DMF）］、抑制淋巴细胞运输［那他珠单抗（natalizumab）、芬戈莫德（fingolimod，FTY720）］和耗竭淋巴细胞群［阿仑单抗（alemtuzumab）、奥曲利珠单抗（ocrelizumab）、米托蒽醌（mitoxantrone），特立氟胺（teriflunomide，TFM）］［26］。目前研究表明这些药物也可以通过对吞噬细胞发挥作用治疗MS。

IFNβ是第一个用于MS 治疗的疾病改良疗法（DMT），是一种抗炎化学因子。IFNβ过去被认为降低BBB 通透性，通过向CD4+Th2 细胞分化抑制T细胞［48］。研究表明IFNβ治疗可以促髓样细胞（巨噬细胞、DC 等）产生IL-27 从而抑制EAE 的Th17 分化［49-50］。也有研究显示IFNβ可通过上调人类单核细胞和巨噬细胞的IL-10 受体，增强人类单核细胞对IL-10 的反应，进而可增强诱导M2 型的表达［51］。另外，KOCUR 等［52-53］研究表明IFN-β可诱导小胶质细胞清除髓鞘碎片。GA 被证明可调节抗原提呈细胞（APC）和Th1-Th2 的平衡，促进辅助T 细胞由Th1 细胞向Th2转化，近年来发现GA可增强小鼠小胶质细胞和人单核细胞的吞噬能力［54］。那他珠单抗属于一种选择性黏附分子抑制剂，可阻止α4 整联蛋白进行整合，通过与VLA-4 整联蛋白结合阻止白细胞穿过血脑屏障［55］。近几年发现那他珠单抗可以在EAE的早期治疗中减少CNS中活化的小胶质细胞和巨噬细胞聚集，也有研究显示其可减少患者单核细胞的mir-155 分子（mir-155 是一种主要与促炎作用相关的微小RNA，可促进M1型的极化［56］），从而减少炎症的发生。FTY720作为鞘氨醇1-磷酸受体的拮抗剂，是第一个FDA 批准的可通过其免疫抑制作用治疗RRMS 的药物，可以阻止鞘氨醇1-磷酸依赖性淋巴细胞从次级淋巴器官流出，也可以阻止白细胞进入CNS［48，57］。在体内FTY720可以很大程度上减弱小胶质细胞的活化，减少促炎化学因子的产生，并促进少突胶质细胞的增殖。QIN等［58］在体内外应用FTY720治疗可以观察到M1 型细胞向M2 型细胞转化，证明FTY720可以直接调节由小胶质细胞、巨噬细胞介导的免疫炎症状态，使其向更好的微环境转化，可促进白质的髓鞘修复和再生。DMF 是2013 年批准的用于RRMS 的免疫调节药物，主要在Th 细胞分化方面发挥作用，其导致记忆T 细胞减少，并可减少Th1/Th17 细胞，增加Th2 细胞［59-60］。目前一项研究采用DMF 治疗严重脑灌注不足的小鼠，结果导致小鼠体内的炎性小胶质细胞和巨噬细胞的数量下降，并减轻患病小鼠的白质损害情况［61］。KORNBERG等［62］研究发现，DMF 可通过抑制鼠巨噬细胞中的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）从而阻断糖酵解途径。DMF 治疗的MS 患者单核细胞中mir-155 表达降低［63］，同时促炎化学因子TNFα、IL-6和IL-10分泌减少，也抑制了EAE 的促炎化学因子iNOS 和TNFα的表达。另外，IFNβ、GA、FTY720 疗法可以减少小胶质细胞和巨噬细胞活化，在MS发病早期阶段有效降低疾病严重程度［64-67］，而DMF 可以抑制由LPS 诱导而来的小胶质细胞的活化［68］。一些可以影响小胶质细胞和巨噬细胞的新型药物正在接受非临床试验，如丙酮酸乙酯降低了活化ED1+巨噬细胞和Iba1+小胶质细胞中HMGB1的表达，从而减少了CNS内的浸润以及活化的巨噬细胞和小胶质细胞数量［69］；福司可林［70］可以通过抑制CD86 的表达并增强巨噬细胞中Arg1 的表达减轻EAE 的严重程度。溴抑制素1［71］（bryostatin-1）通过作用于包括巨噬细胞在内的抗原提呈细胞以促进淋巴细胞分化为Th2细胞，从而改善EAE症状。

目前很多研究试图促吞噬细胞向M2 型细胞转化，提高M2型细胞比率来治疗MS。一些新型的化合物，如白藜芦醇［72］、神经肽Y［73］、丙戊酸［74］、塔夫辛［75］、法舒地尔［12］、来那度胺［76］以及新型PADRE-Kv1.3 疫苗［77］，可以通过抑制M1 型细胞或提高M2 型细胞发挥作用，在未来有望成为治疗MS 的有效方法。miRNA 已被作为潜在的MS 治疗方法，如miR-124、miR223、miR-34a、let-7c、miR-132、miR-146a 和miR-125a-5p 可以在吞噬细胞中诱导M2 型细胞的极化［56］。同样有研究显示，银杏内酯K可通过将M1型 细 胞 向M2 型 转 化 发 挥 治 疗EAE 的 作 用［78］。BENEDEK等［79］研究表明，雌激素治疗可通过促进吞噬细胞向M2型极化预防EAE，并从雌激素治疗的小鼠脊髓中可观察到调节性B细胞的频率增加。

糖皮质激素可以快速且有效地关闭受损的血脑屏障并减轻CNS 的炎症反应，是目前广泛用于急性复发性MS 患者的药物。最近将糖皮质激素递送至以巨噬细胞为靶向的药物递送系统已在EAE中得到广泛应用。研究发现用特定纳米颗粒包装的糖皮质激素比游离的糖皮质激素具有的细胞特异性更强，可优先被吞噬细胞摄取［80］。虽然对MS 的治疗方法有很多，但这些药物难以透过BBB发挥药效，近年来根据在趋化因子的作用下巨噬细胞可以浸润至CNS的特性，提出了利用巨噬细胞为载体，使其成为药物或是作为纳米材料成分以达到治疗效果的概念。这种新型的方法具有前瞻性，相信在未来对治疗MS有很大的帮助。

6 展望

MS是一种复杂的异质性疾病，目前治疗仍面临极大的困难与挑战。目前一些应用于临床的药物不仅能对T 细胞和B 细胞发挥作用，也可调节吞噬细胞。另外，近年来不少物质被证明可以促进吞噬细胞由M1 型向M2 型转化，同时以巨噬细胞为靶向的药物递送系统、以巨噬细胞为载体的药物和纳米材料概念提出，为今后MS 的治疗提供了固有免疫的方案。