E3泛素连接酶介导泛素化修饰在炎症性肠病中的作用机制研究*

张 丹 李茜莹 杨延婷 赵 越 吴丽洁 智方圆 施 征 马晓芃,#

上海市针灸经络研究所1(200030) 上海中医药大学2

泛素化是重要的蛋白质翻译后修饰方式，涉及的酶类主要为E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶(下文简称E3)，主要效应包括蛋白质的降解和功能调节。泛素化修饰与神经退行性变、免疫、炎症、肿瘤等均密切相关，是探索疾病发生机制和治疗的研究热点[1]。

一、泛素化修饰与炎症性肠病(IBD)

泛素化修饰先由E1泛素激活酶活化单个游离泛素，再将活化的泛素传递至E2泛素结合酶，由E3招募特异性底物蛋白和E2泛素结合酶，介导泛素从E2泛素结合酶转移至底物蛋白，最终泛素化的底物蛋白由26S蛋白酶体降解，或改变细胞内定位、活性以及与其他蛋白相互作用，从而调控细胞内多种信号通路的级联反应。泛素化异常参与了IBD的发生和发展，泛素酶及其抗体有望成为克罗恩病(CD)临床诊断和评估病情严重程度的重要标志物。全基因组关联分析(GWAS)研究[2]表明E3 RNF186罕见变异类型与IBD存在相关性。正常人黏膜巨噬细胞 (Mφ)中多种泛素蛋白酶的表达较少，肠道Mφ呈非激活、无反应的功能表型。IBD患者黏膜Mφ为激活表型，泛素蛋白酶表达明显上调，表现为抗原呈递和炎症反应[3]。同时，与正常组比较，实验性结肠炎大鼠结肠组织中泛素mRNA表达明显升高[4]。因此，泛素化异常可能是IBD结肠炎症和免疫损伤发生的重要机制之一。

二、E3的种类和功能

E3是靶蛋白泛素化修饰的关键因素，与靶蛋白、泛素间具有相对特异性。根据E3的结构和功能特点主要分为两大类，即含 HECT结构域的E3和包含环指结构域的RING类E3，前者是唯一一类可与泛素形成硫酯键中间体的泛素连接酶，可直接催化靶蛋白泛素化，后者起到桥梁作用，募集E2泛素结合酶和靶蛋白，完成泛素从E2泛素结合酶到底物蛋白的传递[5-7]。此外，已发现含有两个RING结构域和RBR类 E3，功能尚待深入研究[8]。近年来，一些E3靶向药物已进入临床试验阶段，部分已获美国FDA批准[9]。

三、E3活化参与IBD发病的作用途径

1. 核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)信号通路：NOD蛋白属于胞质内NOD样受体(NLRs)家族，是固有免疫的胞内受体，可识别细菌肽聚糖(peptidoglycan, PGN)。主要通过激活以下几种依赖性信号通路：核因子-κB(NF-κB)途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、干扰素调节因子(IRF)途径诱导炎症反应。NOD信号通路在维持结肠黏膜稳态中起有重要作用，该基因多态性异常与CD有关[10]。NOD2信号通路中关键蛋白的泛素化异常与炎症相关疾病如CD、发作性结节病、Blau综合征有关，多个E3细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)、cIAP2、X链锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2、TRAF4、TRAF5、TRAF6、atrophin-1相互作用蛋白(AIP-4/Itch)、锌指蛋白A20参与其中[11]。受体相互作用蛋白2 (RIP2)是NOD的重要适配蛋白，两者相互作用是活化下游信号通路的关键，该蛋白泛素化是NOD信号通路负调控的重要机制之一。E3(TRAF6)通过自我泛素化修饰，可进一步活化NOD2信号通路的RIP2蛋白，通过NF-κB信号通路，影响CD细胞因子的释放[12]。E3(Pellino3)有调控结肠炎症反应作用，呈现免疫保护效应，该蛋白敲除后可导致实验性肠炎加重，机制可能与其调节RIP2泛素化，影响NF-κB和MAPK信号通路活化有关[13]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是细胞内的重要衔接蛋白，CARD9多态性与人类炎症性疾病有密切关系，可通过影响肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)前炎性因子的表达，调节固有免疫，参与结肠免疫保护效应，该蛋白异常是IBD患病的高风险因素之一[2,14-16]。研究显示，采用小分子化合物选择性抑制E3(TRIM62)-CARD9复合物形成，可调节CARD9 K27或K125多聚泛素化及其依赖性信号通路，具有一定保护效应，可降低IBD发生的风险[14,17]。

2. 髓样细胞分化因子88(MyD88)信号通路：MyD88蛋白含有TIR结构域，是多数TLR和多种包膜受体介导信号通路的共同重要接头蛋白，发挥募集下游激酶和调控信号传递的作用。MyD88依赖性通路中，该蛋白可将IL-1受体相关激酶-4(IRAK-4)吸引至TLR，并与TRAF6发生作用，TRAF6自我泛素化修饰，激活IRAK1/4，最终活化NF-κB和JNK/SAPK信号通路，参与IBD结肠炎症的发生[18]。MyD88非依赖信号通路作为TLR诱导炎症反应的另一个途径，TLR活化后通过激活干扰素β Toll/IL-1R结构域衔接蛋白(TRIF)和 TRAF3，导致NF-κB抑制蛋白激酶ε/TANK结合激酶1 (IKKε/TBK1) 募集，诱导IRF-3磷酸化以及干扰素β的表达，发挥抗病毒作用。TRAF3、TRAF6作为E3成员，对依赖于MyD88和依赖于TRIF(非MyD88)的信号转导具有重要的调节作用，两者可通过泛素修饰效应，调控炎症相关信号通路活化，从而起到免疫防御或缓解炎症的作用。抗原呈递细胞树突细胞(DC)参与调节免疫自稳，A20扮演E3酶或去泛素化酶，对维持免疫静止起重要作用。研究[19]提示，A20依赖性DC可能通过MyD88依赖性(T细胞浸润)和非依赖性(T细胞和抗原提成细胞激活)双信号通路，参与改善IBD和IBD相关关节炎的形成。

3. NF-κB信号通路：NF-κB信号通路是目前认为调控IBD炎症反应的重要信号通路之一。有研究[20]表明，由NOD2诱导的NF-κB必须调节蛋白(NEMO)泛素化修饰能活化IKKα/β，促进NF-κB信号通路，参与CD结肠炎性损伤。近年研究发现，多种E3介导的泛素化修饰均通过调节NF-κB信号通路影响IBD，但作用途径不尽相同。如miR-146b通过减少E3(siah2)表达，抑制TRAF蛋白泛素化，调节NF-κB信号通路以改善结肠炎症[21]；E3(Itch)能影响NOD2结合RIP2，进而调控p38和JNK、NF-κB信号通路活化[22]。上述研究提示蛋白泛素化修饰多发生于模式识别受体(PRRs)下游的一些重要接头蛋白，发挥调控信号通路活化转导的关键作用，而NF-κB信号通路是多条上游信号通路调节的终极靶点之一，参与炎性因子的转录。此外，E3(RNF20/40)能驱动组蛋白H2B单泛素化，调节NF-κB信号通路和靶基因炎性因子转录，是炎症和炎症相关癌症的发生机制之一[23]。有研究[24]表明，E3(TRIM11)p.H414Y 变异是家族性遗传IBD的重要影响因素，可能与其上调NF-κB信号通路中κ轻链增强子核因子有关。

4. NOD样受体蛋白-3(NLRP3)炎性小体：NLRP3属于NLRs家族，与衔接分子CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-1组合成促炎蛋白复合结构，是目前研究较为深入、机制较为清晰的炎性小体。近年来，研究发现NLRP3基因多态性与IBD患者结肠炎严重程度和进展有关[25]。NLRP3炎性小体在维持肠道稳态和预防结肠炎方面发挥重要作用，而E3含有环指结构域的TRIM31可促进NLRP3 K48多聚泛素化，从而促使其进入蛋白酶体降解途径[26-27]。Bednash等[28]的研究显示，E3(A20)不仅通过阻碍NF-κB通路活化，负调控NLRP3转录，同时亦能抑制IL-1β第133位赖氨酸泛素化，该位点泛素化被认为是IL-1β成熟分泌所需，共同参与抑制NLRP3炎性小体活性。Mai等[29]的研究证实，通过促进E3(Parkin)驱动的线粒体自噬，进而抑制结肠NLRP3炎性小体激活，对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎具有抑制作用。由此可见，不同的E3可作用于NLRP3炎性小体的不同组分，但均对炎症反应产生负调控效应。

5. CD4+T细胞：辅助性T细胞(Th细胞)主要包括Th1、Th2、Th17细胞以及调节性T细胞 (Treg细胞)。Th细胞异常在IBD的发生、发展中扮演重要角色，其中CD与Th1和Th17细胞有关，而溃疡性结肠炎(UC)与Th2细胞紧密关联。E3诱导的T细胞无反应性是正常人结肠黏膜免疫耐受机制之一，该功能异常是UC致病的重要步骤。在无反应性患者CD4+T细胞中E3(Grail、Itch、c-Cbl)的表达显著高于反应性人群，E3(Grail)在UC缓解期患者的含量显著高于活动期患者和健康志愿者，提示E3(Grail)在维持UC患者持续缓解中起有重要作用[30]。结肠黏膜miR-290-5p通过调节E3(Grail)参与CD的病理机制[31]。Ramon等[32]的研究发现，Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)作为E3(Itch)的调节蛋白，通过Itch促使JunB泛素化，抑制IL-4和IL-5的产生，可能是Th细胞相关性胃肠炎和IBD的发生机制之一。在体内，E3(Asb2α)可促进Th2表型增加，参与结肠炎模型相关肿瘤的进展[33]。E3(A20)能缓解DSS诱导的结肠炎，可能通过促进脾脏Treg细胞群和结肠组织FOXP3表达实现[34]。

6. 其他：尚有多种E3可通过其他方式调节靶蛋白泛素化修饰，与IBD致病和缓解有关。E3(RNF186)可调节结肠上皮细胞内质网应激来维持肠道稳态，参与结肠炎症反应[35]。E3(Itch)能通过调节结肠上皮细胞增殖、分化、迁移，促使结肠上皮内稳态[36]。miR-26b靶向调节E3(DIP1)，该蛋白下调与死亡相关蛋白酶的稳定性和UC相关结肠肿瘤的发生有关[37]。E3(cIAP2)在UC活动期患者再生上皮细胞中表达上调，可进一步降低上皮细胞链接Fas结构域，对结肠上皮再生有重要影响，可能与UC相关肿瘤的发生相关[38]。E3(Fbxw7)可促进趋化因子CX3CR1高表达的Mφ中组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2降解，上调CCl2/CCl7表达，诱导CX3CR1中度表达的前炎性Mφ聚集于结肠组织，产生炎症反应[39]。

四、展望

蛋白质的泛素化修饰是一个较为复杂的过程，在细胞生命活动中与磷酸化修饰具有同样重要的地位，参与调控机体各种生物学功能。不同E3作用于不同靶蛋白，同一个E3也可作用于多个靶蛋白，均可引起不同的调节效应。泛素化修饰可诱导炎症产生，但同样有抑制炎症反应作用，参与固有免疫的防御或损伤，关键或在于E3及其相应的靶蛋白调控网络。多种E3已被发现与结肠组织病理损伤有关，调控效应涉及增殖、凋亡、应激、炎症反应多方面，泛素化作用靶点呈现了多样性、复杂性。泛素修饰系统的相互作用参与了IBD的损伤和修复，为靶向治疗的合理选择、采取整体治疗提供了一些新思考。