核受体辅活化蛋白7与自噬体蛋白LC3的相互作用

汪林翠，林琼

(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

自噬通过自噬体包裹自噬底物并转运至溶酶体进行降解，从而维持细胞稳态[1-2]。在应激条件下，如饥饿[3]、缺氧[4]、氧化[5]或抗癌药物治疗[6]等，细胞内自噬被激活，以消除应激反应产生的损害[7]。自噬失调与多种疾病的发病机制有关，如神经退行性疾病、代谢紊乱以及癌症等[8]。

微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)是自噬体的重要构成蛋白，与其结合是鉴别细胞内自噬调节蛋白的一个重要标准[9]。核受体辅活化蛋白7(nuclear receptor co-activator 7，NCOA7)能辅助激活核受体，可能是一个自噬调节蛋白[10]，但它与LC3的相互作用及结合位点仍不清楚。本研究以NCOA7蛋白为研究对象，探讨其与自噬蛋白LC3的相互作用及作用位点。

1 材料和方法

1.1 细胞和细胞培养

人肾上皮HEK293细胞，人胃癌AGS细胞，pCDNA3-Myc-NCOA7质粒、表达LC3与谷胱苷肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase，GST)融合蛋白(GST-LC3)的菌液与pGEX-4T-LC3(GST-LC3)质粒均为本实验室长期保存。HEK293细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，AGS细胞用含10%胎牛血清的F12K培养液，在37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 抗体和试剂

鼠抗人Myc标签抗体与异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均为镇江新津生物有限公司产品；HRP标记的羊抗鼠二抗(上海生工生物有限公司)；限制性核酸内切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SpeⅠ与NotⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA连接酶与DH5α大肠埃希菌感受态均为镇江ABM生物公司产品；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL曝光液(上海碧云天生物技术有限公司)；质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒与PCR产物纯化试剂盒均为上海生工生物有限公司产品；谷胱甘肽(glutathione，GSH)琼脂凝珠(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM高糖培养液与F12K完全培养液均为美国HyClone公司产品。

1.3 质谱分析胃癌AGS细胞中的LC3结合蛋白

将GST-LC3融合蛋白亲和固化在GSH标记的琼脂凝珠上，获得GST-LC3琼脂凝珠，同时用GST琼脂凝珠作为对照。实验分为4组：GSH琼脂凝珠与AGS全细胞裂解液孵育作为空载对照组(GSH+WCL)；GST-LC3琼脂凝珠与哺乳动物细胞裂解液孵育作为缓冲液对照组(GST-LC3+buffer)；GST琼脂凝珠与AGS全细胞裂解液孵育为融合蛋白对照组(GST+WCL)；GST-LC3琼脂凝珠与AGS全细胞裂解液孵育作为实验组(GST-LC3+WCL)；分别孵育3～5 h。用哺乳动物细胞裂解液清洗3遍，100 ℃煮沸10 min，离心取上清液。上清蛋白经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色后获得特异性目的条带，质谱分析由北京博奥晶典有限公司提供技术支持。

1.4 GST-LC3沉淀实验检测NCOA7与LC3间相互作用

在HEK293细胞中转染pCDNA3-Myc-NCOA7质粒，48 h后提取细胞蛋白；与此同时，纯化GST(对照)和GST-LC3细菌融合蛋白。将表达GST与GST-LC3融合蛋白的菌液分别扩增12～16 h，用0.25 mmol/L IPTG诱导其表达3 h。超声裂解细菌后，12 000 r/min离心15 min，获得融合蛋白上清液。将GSH标记的琼脂凝珠分别与GST和GST-LC3融合蛋白上清液共同孵育3～5 h，制备成GST和GST-LC3亲和的琼脂凝珠。将GST和GST-LC3琼脂凝珠分别与转染pCDNA3-Myc-NCOA7的细胞蛋白共同孵育3～5 h。用细胞裂解液清洗琼脂凝珠，去除未结合的细胞蛋白。琼脂凝珠100 ℃煮沸10 min使蛋白变性，制成样本，经SDS-PAGE分离。GST与GST-LC3融合蛋白经考马斯亮蓝染色。半干电转印法将其余蛋白转移至PVDF膜，1%牛血清白蛋白溶液37 ℃封闭1 h。加1 ∶3 000稀释的鼠抗人Myc标签一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加HRP羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；ECL荧光显色，凝胶成像系统记录结果。

1.5 分子克隆法构建NCOA7截短体及点突变体

从NCBI网站上查询NCOA7蛋白结构域的氨基酸序列，利用Chromas软件分析NCOA7蛋白的二级结构，根据研究目的确定氨基酸截短位点及点突变位点(通常截短位点位于蛋白质二级结构的β-转角)。用DNA Star软件中的SeqBuilder程序寻找截短位点或点突变位点对应的碱基位置，以此碱基为起点或终点，根据互补配对原则，设计18～24 bp的引物序列，同时需添加保护碱基和酶切位点。

NCOA7全长包含942个氨基酸，含有3个结构域：细胞溶解酶结构域(lysin motif，LysM)、雌激素受体结合结构域(estrogen receptor binding domain，ERbd)和TBC结构域催化结构域(TBC domain catalytic domain，TLDc)。WXX(L、I、V，W：色氨酸，L：亮氨酸，I：异亮氨酸，V：缬氨酸，X：任意氨基酸)是已知的LC3结合基序(LC3 interactive region，LIR)。NCOA7蛋白中含有3个潜在的LIR，分别为310～313位WEDL、692～695位WFAV和747～750位WEII。构建NCOA7截短体及点突变体克隆，截短体包括ΔN105(106～942 aa)、N106- 460(106～460 aa)、N460(1～460 aa)、C721-942(721～942 aa)、ΔN462(463～942 aa)、ΔN650(650～942 aa)和ΔN650-I749/750A(650～942 aa)；点突变体包括L313A(313位亮氨酸突变为丙氨酸)和I749/750A(749和750位异亮氨酸突变为丙氨酸)。NCOA7截短体和点突变体的设计模式图见图1。PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成。以pCDNA3-Myc-NCOA7质粒为模板，每个突变体克隆分别用相应上下游引物进行PCR。PCR产物经试剂盒纯化后，用相应限制性核酸内切酶双酶切，同时酶切pCDNA3-Myc载体，胶回收。用T4DNA连接酶将酶切PCR片段与酶切载体相连，构成完整质粒。用DH5α大肠埃希菌感受态进行转化，将转化产物涂布于含有氨苄抗性的LB细菌培养板，37 ℃过夜培养。挑取单克隆菌落用氨苄抗性的LB液体培养基扩增，菌液行PCR验证。验证正确的菌液提取质粒DNA，由上海生工生物有限公司测序，所用引物序列见表1。

图1 NCOA7不同截短体及点突变体模式图

表1 引物序列

1.6 GST-LC3沉淀实验检测NCOA7截短体、点突变体及其N端截短体及突变体与LC3间相互作用

1.6.1 GST-LC3沉淀实验检测NCOA7截短体及点突变体与LC3间相互作用 利用“1.5”构建的ΔN105，N106-460，N460及C721-942截短体及L313A，I749/750A点突变体质粒转染HEK293细胞，同时转染pCDNA3-Myc-NCOA7野生型质粒(WT)作为阳性对照，48 h后收取细胞蛋白。纯化GST和GST-LC3细菌融合蛋白(方法同“1.4”)。GST琼脂凝珠与WT共同孵育(GST+WT)作为阴性对照组，GST-LC3琼脂凝珠与WT共同孵育作为阳性对照组(GST-LC3+WT)。GST-LC3琼脂凝珠分别与转染ΔN105，N106-460，N460，C721-942，L313A，I749/750A的HEK293细胞蛋白孵育作为实验组。孵育3～5 h，用细胞裂解液清洗GST与GST-LC3琼脂凝珠，去除未结合的细胞蛋白。后续实验步骤与“1.4”相同。

1.6.2 GST-LC3沉淀实验检测NCOA7 N端截短体与LC3间相互作用 利用“1.5”构建的NCOA7 N端截短体ΔN462、ΔN650、C721-942及ΔN650-I749/750A转染HEK293细胞，同时转染pCDNA3-Myc-NCOA7质粒(WT)作为阳性对照，48 h后收取细胞蛋白。用GST-LC3琼脂凝珠分别与此三者细胞蛋白共同孵育。孵育3～5 h，用细胞裂解液清洗GST-LC3琼脂凝珠，去除未结合的细胞蛋白。后续实验步骤与“1.4”相同。

1.7 免疫印迹法检测NCOA7截短体的蛋白表达水平

将HEK293细胞分为4组，阴性对照组转染pCDNA3质粒，阳性对照组转染PCDNA3-Myc-NCOA7质粒，溶酶体抑制剂氯喹处理组和蛋白酶体抑制剂万科处理组分别转染NCOA7截短体ΔN462，ΔN650，ΔN650-I749/750A质粒。36 h后，氯喹处理组加入氯喹(50 μmol/L)处理12 h，万科处理组加入万科(10 μmol/L)处理12 h。每组均加入哺乳动物细胞裂解液，4 ℃摇床裂解30 min；12 000 r/min，4 ℃离心15 min；取上清液煮沸变性；SDS-PAGE分离蛋白，100 V 2.5 h；半干电转法将蛋白转移至PVDF膜，400 mA 2 h；1%牛血清白蛋白溶液37 ℃封闭1 h；4 ℃过夜孵育鼠抗人Myc标签一抗(1 ∶3 000)；次日，TBST清洗3遍；HRP羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)孵育2 h；TBST清洗3遍；用化学发光仪进行ECL显影。

2 结果

2.1 质谱鉴定胃癌AGS细胞中LC3相互作用蛋白

GST-LC3沉淀实验结果显示，空载对照组(GSH+WCL)中40 000以上未出现蛋白条带。缓冲液对照组(GST-LC3+buffer)与融合蛋白对照组(GST+WCL)中出现非特异性蛋白。实验组(GST-LC3+WCL)与3组对照组相比，在170 000、100 000及约60 000处出现特异性蛋白。对特异蛋白行质谱分析，结果中含NCOA7(质谱结果未显示)。见图2。

黑色箭头示特异性蛋白位置图2 GST-LC3沉淀实验检测AGS细胞蛋白

2.2 NCOA7与LC3相互作用

GST-LC3沉淀实验结果显示，与GST对照组比较，GST-LC3实验组从细胞裂解液中沉淀出NCOA7蛋白。考马斯亮蓝染色显示，GST与GST-LC3融合蛋白表达水平基本一致，见图3。

图3 GST-LC3沉淀实验检测NCOA7与LC3相互作用

2.3 NCOA7与LC3相互作用位点位于WEDL基序

GST-LC3沉淀实验结果显示，ΔN105、N106-460、N460、C721-942截短体及I749/750A点突变体均能被GST-LC3融合蛋白沉淀，且C721-942蛋白的沉淀程度明显高于其他突变体。但是，点突变体L313A未被GST-LC3融合蛋白沉淀。在HEK293全细胞裂解液中，截短体及点突变体蛋白表达水平一致。考马斯亮蓝染色结果显示，样本中GST与GST-LC3融合蛋白表达水平一致。见图4。

图4 NCOA7突变体与LC3相互作用

2.4 NCOA7截短体蛋白表达受蛋白酶体抑制

免疫印迹结果显示，在55 000处对照组与实验组均出现非特异性背景条带。氯喹处理组3个截短体质粒ΔN462，ΔN650，ΔN650-I749/750A未有蛋白表达。万科处理组3个截短体质粒有蛋白表达。见图5。

图5 免疫印迹法检测截短体的表达水平

2.5 NCOA7蛋白的651～720氨基酸结构抑制其羧基末端LIR

GST-LC3沉淀结果显示，ΔN462和ΔN650-I749/750A未被GST-LC3沉淀，而ΔN650和C721-942能被GST-LC3沉淀，且C721-942沉淀程度明显高于ΔN650。考马斯亮蓝染色结果显示，样本中GST-LC3融合蛋白表达量基本一致。见图6。

图6 NCOA7 N端截短体与LC3相互作用情况

3 讨论

自噬在肿瘤发生发展中起重要作用，自噬调节蛋白使自噬底物具有特异性[11]。已有研究通过对人类自噬相关蛋白网络分析，发现NCOA7存在于自噬网络[10]，但并未进行具体分析。以往关于NCOA7蛋白的研究主要集中于其辅助核受体激活的功能[12]，而对于其作为自噬相关蛋白的功能并未涉及。本研究主要以HEK293细胞表达为手段，结合GST-LC3沉淀技术检测NCOA7与自噬体蛋白LC3间的相互作用；结果显示，NCOA7蛋白被GST-LC3融合蛋白沉淀，表明NCOA7与LC3之间存在相互作用，NCOA7是自噬相关蛋白。

自噬相关蛋白均包含至少一段LIR，通过与LC3相互作用将底物运送至溶酶体中消化降解[13-14]。本研究中NCOA7蛋白包含3段潜在LIR，然而其与LC3结合的基序尚不清楚。NCOA7截短体的GST-LC3沉淀实验结果显示，ΔN105，N106-460，N460均被GST-LC3融合蛋白沉淀，此三者均包含310～313位WEDL基序，表明WEDL是NCOA7与LC3结合的位点。C721-942被GST-LC3沉淀，说明其包含的747～750位WEII基序是与LC3结合的位置。此外，为避免截短对蛋白功能的影响，用GST-LC3融合蛋白沉淀点突变体L313A与I749/750A。突变体实验结果显示L313A不被沉淀，但I749/750A被沉淀，说明310～313位WEDL基序确实是有功能的LIR，但747～750位WEII基序受分子内结构的调节。

蛋白质的降解途径主要有两种，溶酶体途径和蛋白酶体途径[15-16]。本研究中，ΔN462，ΔN650与ΔN650-I749/750A截短体质粒构建后，在HEK293细胞中并不表达(结果在文中未给出)，故分别用溶酶体抑制剂氯喹或蛋白酶体抑制剂万科处理。蛋白质免疫印迹法结果显示，三个截短体蛋白在氯喹处理组中未检测出，但万科处理组均检测出，提示NCOA7截短体可能通过蛋白酶体途径降解。ΔN462，ΔN650，C721-942与ΔN650-I749/750A截短体的GST-LC3沉淀实验结果显示，ΔN462未被沉淀；ΔN650被沉淀但沉淀的蛋白较少，表明其与LC3结合较弱；C721-942被沉淀且沉淀的蛋白较多，表明其与LC3结合较强，说明调节747～750位LIR的结构位于651～720位氨基酸内。ΔN650-I749/750A不能被GST-LC3沉淀，表明692～695位WFAV基序不具有LIR功能。

综上，本研究结果表明NCOA7的N端WEDL基序和C端WEII基序是LC3的结合位点，但在正常情况下，NCOA7 651～720氨基酸区域内的分子结构抑制其C端WEII基序的功能。由此显示NCOA7很可能是一个自噬调节蛋白。