叶酸对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

夏艳，马晓冬，谢云斌，邵东华

(1.江苏大学附属医院麻醉科，江苏 镇江 212001；2.江苏大学附属人民医院麻醉科，江苏 镇江 212002；3.常州市第一人民医院麻醉科，江苏 常州 213000)

肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury，LIRI)是指缺血的肺在血流灌注恢复后，其组织病理损伤进一步加重的一系列级联反应，常发生于肺栓塞溶栓术后、体外循环、肺移植术后等，临床表现常与急性呼吸窘迫综合征的急性阶段类似[1]。LIRI的进展直接导致机械通气时间延长，增加患者入住ICU的风险，延长住院时间并致患者死亡率升高[2]。叶酸是临床一线使用的B族维生素，已证实能从细胞水平改善能量代谢，从而减少脑缺血再灌注的损伤[3]，亦能改善心肌缺血期间的心功能、减轻心肌再灌注损伤[4]。但是，叶酸在肺缺血再灌注中是否具有保护作用尚不明确，本研究将就此作一探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠30只，体质量300～350 g，由江苏大学实验动物中心提供，合格证编号：201708847，201709565。本研究过程中遵从国际有关动物实验和临床研究的基本伦理和准则，并通过江苏大学附属人民医院伦理审查委员会审查批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 叶酸片购自常州制药厂有限公司；大鼠血清IL-8 ELISA检测试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司；大鼠血清TNF-α ELISA试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；小动物呼吸机购自加拿大Mexico公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与喂养 维持大鼠自然昼夜节律，自由进食水。随机均分为假手术组、肺缺血再灌注组和叶酸组(5、10、20 mg/d)，每组6只，其中叶酸组于造模前分别以叶酸剂量5、10、20 mg/d灌胃1周。

叶酸片溶于生理盐水，配制成2.5 mg/mL的叶酸悬浮液，保存于4 ℃冰箱备用。叶酸组大鼠分别按每只每天2、4、8 mL灌胃。考虑到大鼠的胃容量，实际操作时每日分2次分别于8:00和17:00各灌胃1、2、4 mL。

1.2.2 肺缺血再灌注模型构建 7%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 mL/100 g)。纵行剪开颈部气管前皮肤，钝性分离皮下组织、颈部肌肉，将甲状腺牵拉至气管一侧，显露气管。大约于第二、三气管软骨环位置横行切开气管，并向下做约0.5 cm长的T形切口，插入自备的气管导管(临床用头皮钢针上的橡胶软管的外径适合插入大鼠气管，内径满足机械通气的阻力和流量要求，可用作本实验中大鼠的气管导管)1 cm，丝线结扎固定。连接小动物呼吸机，吸空气，容量控制模式，设置压力0.02～0.25 MPa，频率70 r/min，吸呼比1 ∶2.5，潮气量10～12 mL/kg。缺血再灌注组和叶酸组以改良的Eppinger法[5]手术，结扎左侧肺门30 min后再灌注2 h；假手术组气管插管后只打开胸腔不结扎肺门，机械通气2.5 h。术中根据需要间断追加水合氯醛(诱导量的1/4～1/3)维持麻醉。

手术结束后，显露大鼠心脏，注射器垂直刺入左心室取血，处死大鼠。所取血液经4 ℃行3 000 r/min离心10 min；取上清液保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 肺组织病理观察及评分

1.2.3.1 HE染色观察肺组织病理 处死大鼠后即取左侧肺组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，浸泡于4%低聚甲醛溶液中固定24～48 h。标本经梯度乙醇脱水、二甲苯浸泡透明、浸蜡、包埋、切片、烘烤脱蜡、梯度乙醇脱苯、苏木素核染、清洗和组织分化、伊红工作液质染、梯度乙醇脱水、二甲苯浸泡透明、中性树胶封片后，光镜下观察肺组织病理变化。

1.2.3.2 肺组织病理评分 按Smith法[6-7]从肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、肺不张和透明膜形成等方面对肺组织损伤进行病理评分，标准如下：0分，无损伤；1分，病变范围<25%；2分，25%<病变范围≤50%；3分，50%<病变范围≤75%；4分，病变范围>75%。高倍镜下观察10个视野，取其平均值。

1.2.4 ELISA法测定血清IL-8和TNF-α浓度 96孔板设置空白孔、标准孔、待测样品孔。标准孔和待测样品孔加入标准品或待测样品100 μL，空白孔不加样；37 ℃(或室温)反应2 h；弃液、洗孔，每孔加生物素化的抗IL-8(或TNF-α)抗体100 μL，37 ℃(或室温)反应1 h；弃液、洗孔，每孔加HRP标记的亲和素100 μL，37 ℃(或室温)反应1 h(或20 min)；弃液、洗孔，每孔加入TMB溶液90 μL(或100 μL)，37 ℃(或室温)避光显色30 min(或20 min)左右，至肉眼可见标准品孔呈现明显的梯度蓝色；每孔依次加入终止液50 μL，见蓝色转为黄色；用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(D值)；计算样品浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 叶酸减轻大鼠肺缺血再灌注后肺组织损伤

HE染色光镜下可见，假手术组肺组织内结构大致完整，肺泡间隔大致正常；肺泡内未见明显渗出液，肺间质未见明显水肿和炎症。缺血再灌注组弥漫性肺泡和肺间质出血、水肿，部分肺泡破裂融合，肺泡间隔增厚。3个叶酸组大鼠肺组织损伤均较缺血再灌注组减轻。Smith评分结果显示，与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠肺组织损伤明显较重(P<0.01)；与缺血再灌注组比较，3个叶酸组大鼠肺组织病理损伤明显较轻(P均<0.01)；与5 mg/d叶酸组比较，10 mg/d与20 mg/d叶酸组大鼠肺组织病理损伤明显较轻(P均<0.01)，而后两组间比较未见显著性差异(P>0.05)。见图1和图2。

图1 各组大鼠肺组织病理变化比较(×200)

a:P<0.01，与假手术组比较；b:P<0.01，与缺血再灌注组比较；c:P<0.01，与5 mg/d叶酸组比较图2 各组大鼠肺组织损伤的Smith评分比较

2.2 叶酸降低大鼠肺缺血再灌注后血清IL-8和TNF-α表达

由图3可见，与假手术组比较，缺血再灌注组、叶酸组IL-8表达水平均明显增高 (P均<0.01)；与缺血再灌注组比较，3个叶酸组IL-8表达水平明显降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

由图4可见，与假手术组比较，缺血再灌注组、叶酸组TNF-α表达水平均明显增高 (P均<0.01)；与缺血再灌注组比较，3个叶酸组TNF-α表达水平明显降低(P均<0.01)；与5 mg/d叶酸组比较，10 mg/d与20 mg/d叶酸组TNF-α表达水平明显降低(P均<0.05)，而后两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

a:P<0.01，与假手术组比较；b:P<0.01，与缺血再灌注组比较；c:P<0.05，与5 mg/d叶酸组比较；d:P<0.05，与10 mg/d叶酸组比较图3 各组大鼠血清IL-8水平比较

3 讨论

LIRI临床特征表现为微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺水肿、氧合受损以及肺动脉高压[8]。其他组织学标志包括肺泡毛细血管间质水肿、沿肺泡管的透明膜化和中性粒细胞、巨噬细胞、多形核细胞浸润[9-11]。

a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.01，与缺血再灌注组比较；c:P<0.05，与5 mg/d叶酸组比较图4 各组大鼠血清TNF-α水平比较

本研究成功构建LIRI大鼠模型，缺血再灌注后肺损伤病理表现为肺泡和肺间质出血、水肿，肺泡间隔增厚等。而叶酸组的病理损伤较缺血再灌注组轻，提示叶酸在LIRI过程中有保护作用。

血浆或支气管肺泡灌洗标本中存在多种潜在的生物标志物。在促炎细胞因子中，TNF-α，IL-1b，IL-6，IL-8和IL-18是预测发病率和死亡率的比较有价值的分子生物标志物[12]。Fisher等[13]研究显示，供体支气管肺泡灌洗液中IL-8水平升高与早期严重移植物功能障碍和移植受体早期死亡率相关。再灌注后2 h IL-8水平与PaO2/FiO2、气道压力和ICU停留时间相关[14]。TNF-α是LIRI完全性进展中最重要的炎症因子之一，其过量生成是诱导炎症基因表达、细胞死亡以及免疫细胞聚集和激活的关键[15]。另有研究表明，TNF-α在调控上皮通透性和调节肺微血管内皮中发挥作用[16]，TNF-α抗体的应用使肺血管损伤降低49%[17]。在肺微血管通透性增加的初始和后期阶段都与IL-8和TNF-α密切相关[18]。上述研究表明，LIRI越重，IL-8和TNF-α表达水平越高。本研究中，叶酸组血清IL-8、TNF-α表达水平均明显低于缺血再灌注组，说明叶酸组大鼠肺损伤程度较缺血再灌注组轻，提示叶酸预喂养抑制组织IL-8和TNF-α产生和(或)释放，从而在LIRI过程中起到保护作用。

研究表明[4]，受试者接受200～1 000 mg叶酸，均证实在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用，显示叶酸宽广的治疗和安全范围。本研究中3个治疗剂量叶酸均对大鼠LIRI有保护作用，并随剂量增加，保护作用增强。但是，10 mg/d与20 mg/d叶酸组大鼠肺损伤病理评分及血清TNF-α水平未见显著性差异，而IL-8水平呈剂量依赖性降低，故10 mg/d与20 mg/d叶酸对大鼠LIRI的保护作用是否有差异、叶酸对大鼠LIRI的保护作用的有效治疗剂量范围尚需更多实验数据探讨和支持。多项研究证实，叶酸在全身各组织器官的缺血再灌注损伤过程中有保护作用：通过影响同型半胱氨酸水平[19]、自噬过度激活[20]等发挥在脑缺血再灌注中的保护作用；通过维持心肌高能磷酸盐的水平从而维持缺血期间的心功能并且减轻再灌注损伤[4]；通过改善回肠毛细血管内血液的流动性减轻肠缺血再灌注损伤[21]；通过清除氧自由基、维持有效的抗氧化活性而用于男性不育症的治疗[22-23]等。本研究显示叶酸在大鼠LIRI中有保护作用，但并未涉及相关机制的探讨。研究显示[4]，缺血心肌的ATP和ADP下降超过66%，而两者的水平在叶酸预处理心肌中均能较好地维持。ATP作为机体活细胞中共有的直接能量来源，其水解为ADP遵循固定的公式，即在心肌和肺中的代谢是统一的过程，故推测叶酸在大鼠LIRI中的保护作用亦可能与细胞高能磷酸盐的代谢有关，此可作为后续相关保护机制探索的一个参考方向。