肾透明细胞癌组织VEPH1表达降低并与不良预后相关

胥传海，兰建云，徐林成，李蕾，周林森

(盐城市第一人民医院 1.病理科；2.普外科，江苏 盐城 224500)

肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，约占肾癌的85%，肾细胞癌在我国发病率居泌尿系恶性肿瘤第2位[1]。最新研究显示肿瘤的发生和进展与细胞的代谢紊乱息息相关，糖和脂肪的代谢异常在KIRC中发挥关键作用[2-3]。

心室区表达PH域的蛋白质同源物1(ventricular zone-expressed PH domain-containing protein homo-log 1，VEPH1)基因于2000年首次在人胚胎脑组织中发现，在人肾脏、胰腺、脾脏和胚胎脑组织中高表达[2,4-5]。既往研究发现，VEPH1定位于蛋白羧基端的结构域是一种常见的蛋白组件，存在于200多种信号传导蛋白及细胞骨架蛋白中。VEPH1参与蛋白质—脂质、蛋白质—蛋白质之间的相互作用，影响胞内物质运输和定位，参与信号传导和细胞骨架的构成[6]。本研究应用癌症基因组图谱(The Can-cer Genome Atlas,TCGA)数据库和人类蛋白质图集(The Human Protein Atlas,HPA)数据库探讨VEPH1基因与KIRC患者预后的关系及其潜在的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 VEPH1基因表达差异及其与KIRC预后关系分析

GEPIA(http:∥gepia.Cancer-pku.cn/index.Html)是由北京大学开发的交互式web服务器。在TCGA的KIRC数据中检索VEPH1，主要分析条件如下，“Expression DIY”模块：Boxplot中选择“VEPH1”、“KIRC”及“Match TCGA normal and GTEx data”。选择“Survival”模块：Survival Plots中选择“VEPH1”、“Overall Survival”及“KIRC”，进行Mantel-Cox检验分析，并导出总生存曲线图。基于该数据库的测序数据，统计分析VEPH1基因在肿瘤组织与癌旁组织中的表达差异，VEPH1在正常肾组织和KIRC组织中的表达差异，VEPH1基因与KIRC预后的相关性。R3.6.2软件设计配对t检验函数，比较100例患者肿瘤和癌旁组织中VEPH1基因的表达量是否有显著差异。

1.2 VEPH1基因与KIRC患者预后关系的分析

TCGA数据库下载整理530例KIRC的基因表达数据和临床数据，使用R3.6.2版本软件的“survival”包分析，单因素分析各临床指标与患者生存是否相关。

1.3 VEPH1蛋白在肿瘤和癌旁组织表达分析

从HPA数据库下载3例正常肾脏组织和10例KIRC组织VEPH1免疫组化结果(抗体编号:HPA026645)，分析VEPH1蛋白的表达。

1.4 Cbioportal数据库分析VEPH1在KIRC组织中表达降低的原因

利用Cbioportal(https:∥www.cbioportal.org/)网站，搜索VEPH1基因在TCGA数据库448例KIRC患者肿瘤组织中的错译率与突变率(筛选条件：Kidney Renal Clear Cell Carcinoma,TCGA,Firehose Legacy)。

1.5 基因集富集分析(GSEA)分析VEPH1基因在KIRC中主要参与的通路

根据TCGA数据集538例KIRC患者基因表达谱数据，运用GSEA软件分析VEPH1表达水平与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路基因集的相关。在GSEA中，使用h.all.v7.1.symbols.gmt c2.作为参照基因集，将P<0.05及错误发现率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作为显著富集的基因集。

2 结果

2.1 VEPH1在KIRC肿瘤与癌旁组织中的表达差异

利用GEPIA平台泛肿瘤分析发现，VEPH1mRNA在人体正常器官组织中广泛表达，但是，在KIRC中，VEPH1在肿瘤组织与癌旁组织中表达差异最大(图1A)。TCGA数据库523例KIRC肿瘤组织与100例癌旁组织VEPH1mRNA表达的分析结果显示，KIRC肿瘤中VEPH1mRNA表达水平显著低于癌旁组织(t=12.64，P<0.05)，见图1B。配对比较100例KIRC患者肿瘤与癌旁组织中VEPH1mRNA表达，结果显示VEPH1mRNA在肿瘤组织中明显降低(图1C)。

2.2 VEPH1在KIRC肿瘤和癌旁组织中的蛋白表达

从HPA数据库下载3例正常肾组织和10例KIRC肿瘤组织VEPH1免疫组化结果，VEPH1蛋白在正常肾组织中普遍呈高表达(图2)，而10例KIRC肿瘤组织中2例呈高表达，6例呈中表达，2例呈低表达，且主要定位于核质，呈棕褐色。KIRC肿瘤中VEPH1在mRNA水平和蛋白水平的表达相对一致，且均较正常肾组织呈现表达下调。

A：GEPIA平台泛肿瘤分析；B：KIRC肿瘤组织中VEPH1 mRNA表达量显著低于癌旁组织；C：配对比较100例KIRC患者肿瘤组织与癌旁组织VEPH1 mRNA表达图1 生物信息学分析VEPH1基因在KIRC与癌旁组织中的表达

图2 VEPH1蛋白在正常肾组织(左图)和KIRC组织(右图)中的表达

2.3 VEPH1低表达与KIRC患者预后相关

GEPIA网站分析VEPH1mRNA表达与患者生存期长短的相关性(图3)，结果显示KIRC肿瘤中的VEPH1表达越低，患者生存期越短(P<0.05)。单因素COX回归分析提示KIRC患者预后与年龄、淋巴结受累、VEPH1mRNA表达均显著相关(表1)。

表1 KIRC患者生存预后与临床病理参数和VEPH1表达的关系

图3 VEPH1 mRNA表达与KIRC患者生存期的关系

2.4 VEPH1 mRNA低表达原因分析

登录Cbioportal网站，搜索VEPH1基因在TCGA数据库448例KIRC患者肿瘤组织中的错译率与突变率，仅出现2例错译与突变，扩增的概率仅为1.1%(图4)。VEPH1mRNA在KIRC肿瘤中表达降低的原因，推测主要是与肿瘤环境改变有关，而不是与基因的错译或者突变有关。

A：448例患者仅有2例发生错译与突变；B：仅有1.1%的患者发生基因扩增图4 TCGA数据库448例KIRC患者基因突变测序分析

2.5 VEPH1功能富集分析

分子标签数据库选择c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt[Curated]数据库，高表达VEPH1的KIRC样本中，在多种代谢相关的通路上显著富集，包括丙酮酸代谢，色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多种重要的氨基酸代谢，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代谢(图5)。根据标准化P值判断，与代谢通路相关显著的所有基因集名称具体见表2。

图5 GSEA数据库分析VEPH1高表达相关基因集的富集

表2 GSEA分析VEPH1高表达富集的相关通路统计

3 讨论

本研究分析VEPH1在TCGA数据库中的测序信息以及患者临床信息，首次发现VEPH1在KIRC组织中mRNA和蛋白水平均较正常肾组织表达量显著降低；肿瘤组织中VEPH1mRNA高表达KIRC患者生存期显著高于低表达的患者。大样本统计肿瘤中VEPH1测序结果，VEPH1mRNA在肿瘤组织中只有极少数是错译和突变，另外仅存在1.1%的基因扩增。GSEA功能富集分析表明，VEPH1在KIRC肿瘤中高表达相关基因集主要富集在多种代谢通路中。因此，推测VEPH1在肿瘤中低表达，可能是与多种重要的氨基酸、糖类以及三酰甘油代谢通路活动降低相关，这些代谢活动减弱导致患者预后差，生存期显著低于高表达患者。因此，VEPH1具有作为KIRC病理诊断标志物的潜在价值。

GSEA分析结果显示，VEPH1在KIRC组织中的表达量与丙酮酸代谢及色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多种重要的氨基酸代谢有关，提示VEPH1与色氨酸及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路有关，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代谢相关[7-8]。有研究显示，肿瘤细胞在有氧条件下，同时存在无氧酵解，共同提供自身需要的代谢及增殖需要的能量[9]。GSEA分析显示VEPH1高表达富集在三酰甘油通路，患者VEPH1高表达时，可能是由于三酰甘油代谢较低表达患者好，因此预后比低表达患者好[10]。VEPH1在KIRC组织中的表达量与丙酮酸相关，而丙酮酸浓度的改变可作为糖的有氧氧化和无氧酵解的分界点，丙酮酸代谢下降时，胞内丙酮酸的浓度升高，为KIRC肿瘤细胞的无氧酵解提供了丰富的前体物质[11-12]。肾癌患者血清中谷氨酸浓度较健康者升高，谷氨酰胺的浓度降低，可能是由于肾癌患者VEPH1表达普遍降低，与VEPH1相关的谷氨酸代谢降低相关[13]。VEPH1高表达肾癌患者的预后要好于低表达患者，推测是由于谷氨酸和谷氨酰胺浓度的增加促进了谷胱甘肽的生成，提高了癌细胞的抗氧化能力，因此可能影响患者的预后[14]。越来越多的研究表明，代谢通路的异常与肾癌尤其是KIRC患者预后的关系极为密切[15]。

综上所述，本研究通过生物信息学方法揭示了VEPH1可能参与KIRC的发生、发展，并具有作为KIRC诊断标志物、预后指标及治疗靶点的潜在应用价值。但VEPH1在KIRC中的作用及其机制还有待后续实验予以证实及丰富。