特发性膜性肾病患者肾组织中SOD2和IgG4的表达及意义

王斯 ，刘茂东 ，迟雁青 ，康英丽 ，李英

（1.杭州市中医院，浙江 杭州 310007；2.河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050017）

氧化应激与肾脏疾病的发病关系密切，其参与海曼肾炎（IMN动物模型）[1-2]、糖尿病肾病及慢性肾衰竭等[3-4]发病过程。锰超氧化物歧化酶（SOD2）属于金属酶类，是抗氧化细胞保护系统的主要组成部分，可将毒性的超氧化物阴离子（02-）转化为过氧化氢和双原子氧，在机体氧化与抗氧化平衡中起重要的作用，与很多疾病的发生发展密不可分[5-6]。近年来，特发性膜性肾病（IMN）的发病率逐年上升，但具体发病机制未知，目前认为与IMN产生的特异IgG4足细胞自身抗体和抗原结合形成上皮下免疫复合物、激活补体系统后导致足细胞损伤和凋亡、产生大量蛋白尿有关。国外学者Prunotto等[7]用结合蛋白组学法测定人类IMN患者血清和肾小球中的抗足细胞膜蛋白抗体，在患者血清中发现了SOD2和IgG4抗体，免疫荧光检测到SOD2及IgG4共同沉积在肾小球中。本文主要探讨SOD2在IMN患者肾组织中的表达及其与IgG4表达部位的关系，为SOD2在IMN发病中的作用提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年6-12月河北医科大学第三医院经肾活检确诊的IMN住院患者，并选择同期继发性膜性肾病（SMN）、微小病变性肾病（MCD）住院患者作为对照。纳入标准：（1）临床及肾活检病理检查均符合 IMN、SMN、MCD的诊断，SMN患者临床上须有继发因素，肾活检病理符合不典型膜性肾疾病理表现；（2）既往未接受过激素、免疫抑制剂或肾移植治疗。排除标准：合并其他肾脏、心脏、肝脏疾病及糖尿病等系统性疾病。IMN组41 例，男 19 例，女 22 例，年龄（5.8±13.0）岁；SMN组 13 例，男6 例，女 7 例，年龄（8.6±14.2）岁；MCD组 6 例，男 4 例，女 2 例，年龄（2.8±14.8）岁。三组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会审批通过且患者知情同意。

1.2 方法 收集患者性别、年龄、24小时尿蛋白定量、血肌酐等资料。免疫组化法检测患者肾组织SOD2及IgG4的表达：肾组织蜡块切片后脱腊并进行抗原修复，后将切片放入3% H2O2溶液中清除内源性过氧化物酶，滴加一抗，滴加二抗孵育，DAB显色，苏木素复染细胞核，经分化、返蓝、脱水、透明后封片。显微镜随机选取10个视野，用Image-ProPlus 6.0软件进行半定量分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料采用（±s）表示，正态分布资料多组间比较采用方差分析；计数资料用百分率表示，并采用χ2检验；相关性检验采用线性相关分析。

2 结果

2.1 SOD2和IgG4的表达 （1）SOD2在各组的肾小管上皮细胞中均有表达，且表达无明显差异；SOD2在IMN组肾小球中有一定表达，在SMN组和MCD组肾小球中仅微量表达（图1A-1C）。肾小球基底膜、上皮下SOD2的表达IMN组较SMN组、MCD组均显著增强，差异有统计学意义（P＜0.01），SMN组与MCD 组差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）IgG4 在IMN组肾小球基底膜、上皮下均有表达，而在SMN组、MCD组肾小球基底膜中未见表达（图1D-1F）。IMN组与SMN组、MCD组比较，肾小球内IgG4表达增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；SMN 组与 MCD组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 三组SOD2和IgG4在肾小球基底膜、上皮下的表达

2.2 相关性分析 在IMN组中，肾小球内SOD2的表达与24小时尿蛋白定量呈显著负相关 （r=-0.354，P=0.023）；IgG4 的表达与 24 小时尿蛋白定量呈正相关（r=0.361，P=0.021）；SMN 组、MCD 组肾小球内SOD2、IgG4的表达与24小时尿蛋白定量均无相关性（P＞0.05）。详见表 2。

表2 三组SOD2/IgG4与24小时尿蛋白定量的相关性

3 讨论

SOD2是广泛的抗氧化细胞保护系统的重要组成部分，存在于人体细胞线粒体基质内[8-9]，可将毒性的超氧化物离子（02-）转化为过氧化氢和双原子氧，对抗并阻断氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，在清除自由基、维持线粒体及机体氧化应激平衡中具有重要作用。在肾脏中，SOD2广泛表达于肾小管上皮细胞[10]，特别是皮质，而在肾小球中的表达则少见报道[7]，SOD2在肾脏表达的升高与肾脏的毒性损伤密切相关。

本研究发现，SOD2在各组肾小管上皮细胞中均有表达，且表达无明显差异，这与文献报道基本一致[7]。同时，SOD2在IMN肾小球基底膜、上皮下表达水平较高，在SMN组、MCD组仅微量表达，且SOD2在IMN中的表达水平与24小时尿蛋白定量呈负相关，在SMN组、MCD组中未发现存在相关性，提示SOD2可能是IMN肾小球特异性表达的物质，推测IMN发病过程中可能存在肾脏的氧化损伤，导致足细胞受损，大量SOD2从线粒体中释放，发挥抗氧化功能，修复受损细胞，降低尿蛋白的产生，对肾脏起到积极的保护作用，同时在氧化与抗氧化过程中发挥重要作用。

Mubarak等[11-13]检测了IMN患者肾脏中抗足细胞抗体的种类及含量，发现IgG4是所有抗体中最常见的亚型，抗体滴度IMN比健康人和病理对照组均高，肾活检组织中可观察到IgG4和C3呈颗粒状沉积在肾小球基底膜，电镜可见免疫复合物沉积在肾小球基底膜上皮下。本研究结果显示，IgG4在大部分IMN患者肾小球基底膜上皮下均有表达，较SMN、MCD表达显著增强，与文献报道一致。且IMN组IgG4的表达水平与24小时尿蛋白定量呈正相关，在SMN组、MCD组中未发现存在相关性。由此证实IgG4为IMN的主要致病抗体，与蛋白尿的形成密切相关。

图1 三组肾组织中SOD2和IgG4的表达。1A-1C：SOD2在IMN、SMN、MCD中的表达，红色箭头标注的为SOD2在肾小管上皮细胞的表达（棕色着色区），绿色箭头标注的为SOD2在肾小球基底膜、上皮下的表达（棕色着色区）；1D-1F：IgG4在IMN、SMN、MCD中的表达，蓝色箭头标注为IgG4在肾小球基底膜、上皮下的表达 （棕色着色区）。 （En Vision×200）

有国外学者在IMN患者血清中检测到特定的抗SOD2 IgG4抗体，其将IMN肾小球微切割后也洗脱出高滴度的抗SOD2 IgG4抗体，推测SOD2在肾组织中的表达及抗体的形成可能与IMN的发病过程有关[7]。本研究观察到SOD2与IgG4在IMN肾小球中的表达部位基本一致，均沉积在肾小球基底膜及上皮下，由此推测，SOD2不仅在氧化应激时对肾组织具有保护作用，当氧化应激过度时，SOD2也可能作为一种足细胞致病抗原，与IgG4形成免疫复合物，沉积在肾脏，激活补体系统后形成膜攻击复合物致足细胞损伤，参与IMN的发病过程。

综上所述，SOD2在IMN肾小球基底膜、上皮下表达增高，且与24小时尿蛋白定量呈负相关，提示SOD2在IMN肾脏氧化物应激时对机体起保护作用，降低尿蛋白的产生；SOD2与IgG4均在IMN肾小球基底膜上皮下沉积，推测SOD2也可能作为足细胞致病抗原参与IMN的发病过程。