血液循环中微小RNA-140-3p和Toll样受体4表达与冠心病患者经皮冠状动脉介入术后支架内再狭窄的关系研究

冯六六，白艳艳，史骏，刘天华，刘新兵，单蓉

本研究价值：

近年在心血管疾病的病理机制和靶点研究中，微小RNA（miRNAs）因具有高度保守性和表达时序性，在循环系统中表达相对稳定，而颇受研究者关注，是一种理想的分子标志物。目前研究已证实，多种miRNAs对冠心病具有一定诊断价值，但与经皮冠状动脉介入术（PCI）后支架内再狭窄的关系研究较少。本研究发现血液循环中miR-140-3p和Toll样受体4（TLR4）表达对冠心病患者PCI后支架内再狭窄的预测价值较高，可作为预测冠心病患者PCI后支架内再狭窄的生物标志物。

经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）能够在紧急情况下快速开通梗死血管，缓解心肌损伤，是冠心病患者的主要血运重建方法，但术后支架内再狭窄的发生在很大程度上影响了患者的预后［1-2］。近年有学者提出支架内新生动脉粥样硬化（in-stentneoathe neoatherosclerosis，ISNA）的概念，并认为ISNA是PCI后支架内再狭窄的主要原因［3］。病理学研究发现，在ISNA中存在大量富含脂质的巨噬细胞及局部浸润的淋巴细胞、嗜酸粒细胞，这一发现揭示了免疫炎性反应在ISNA发生、发展过程中发挥着重要作用。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是参与冠心病循环系统炎性反应和内皮功能损伤的经典标志物，其与斑块产生及破裂密切相关［4］。本研究旨在分析血液循环中TLR4、微小RNA（miR）-140-3p表达与冠心病患者PCI后支架内再狭窄的关系，并发现调控TLR4的上游miR-140-3p也是冠心病的潜在生物标志物，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取上海市杨浦区市东医院2016年7月—2017年12月收治的行PCI的285例冠心病患者作为病例组，均符合《临床冠心病诊断与治疗指南》［5］中的冠心病诊断标准，并具备PCI指征。根据有无发生支架内再狭窄将冠心病患者分为再狭窄亚组（n=44）和无再狭窄亚组（n=241）。另选取同期在上海市杨浦区市东医院进行健康体检的300例中老年（45～75岁）健康志愿者作为对照组。本研究经上海市杨浦区市东医院伦理委员会审核批准（伦理号：2016-012-01），所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）临床病理资料完整；（2）随访资料完整，且随访时间≥2年。排除标准：（1）合并传染性疾病者；（2）合并免疫系统疾病者；（3）合并肿瘤者；（4）合并任何原因引发的感染者；（5）合并哮喘或过敏体质者。

1.3 观察指标

1.3.1 临床资料 详细统计患者的临床资料，主要包括人口学特征、合并症、生活习惯、实验室检查指标、影像学资料。其中人口学特征包括年龄、性别、身高、体质量，并计算体质指数（BMI）。合并症包括高血压、糖尿病发生情况。生活习惯包括吸烟、饮酒及熬夜情况，吸烟定义为吸烟指数（平均每日吸烟支数×吸烟年数）≥50支年；饮酒定义为平均乙醇摄入量＞25 g/d；熬夜定义为平均超过24：00入睡≥3 d/周。实验室检查指标包括血脂四项〔总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）〕、空腹血糖、心肌酶谱〔肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）〕、炎性标志物〔超敏C反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原（PCT）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）〕及外周血miR-140-3p、TLR4表达情况，其中血脂四项、空腹血糖、心肌酶谱及炎性标志物均采用罗氏诊断产品（上海）有限公司提供的cobas ®c 311全自动生化分析仪及其配套试剂或试剂盒进行检测。采用荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两组受试者外周血miR-140-3p、TLR4相对表达量，主要步骤如下：（1）冠心病患者于PCI前、健康志愿者于体检当天抽取血样本，-80 ℃超低温环境下存储血样，且未经过反复冻融。（2）取出血样并于无菌操作台上处理，先在冰上自然溶解，然后采用miRNAs提取试剂盒（检测miR-140-3p）或总RNA提取试剂盒（检测TLR4）提取全血样本的miRNAs或总RNA，鉴定RNA质量是否合格。（3）采用通用的RT-PCR试剂盒进行反转录，根据说明书要求配置常规反转录体系，置入PCR管，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s，4 ℃存贮，准备扩增。（4）根据试剂盒要求配置扩增体系，引物如下：miR-140-3p正向引物5'-ACACTCCAGCTGGGAGGCGGGGCGCCGCGGG A-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。TLR4正 向引物5'-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3'，反向引物5'-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3'；GAPDH正 向引物5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物5'-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。（5）扩增完成后，根据公式（2-ΔΔCt）分别计算 miR-140-3p、TLR4相对表达量。影像学资料主要包括冠状动脉狭窄支数、冠状动脉狭窄率及左心室射血分数（LVEF）。

1.3.2 PCI情况 记录患者支架植入情况（包括支架长度、内径）、随访期间支架内再狭窄发生情况。支架内再狭窄判断标准：PCI后出现血管介入部位心肌梗死、心绞痛，或复查冠状动脉造影显示支架内、近端及远端5 mm范围的管腔直径狭窄率≥50%，参考血管为支架远端5 mm外的正常血管［6］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件和MedCalc v19.0.7分析数据。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验；不符合正态分布的计量资料以M（QR）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验；冠心病患者PCI后支架内再狭窄的影响因素分析采用多因素Logistic回归分析；绘制ROC曲线以评价PCT、miR-140-3p相对表达量、TLR4相对表达量及LVEF对冠心病患者PCI后支架内再狭窄的预测价值，并采用Hanley-McNeil非参数法比较曲线下面积（AUC）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组外周血miR-140-3p、TLR4相对表达量比较 病例组患者miR-140-3p相对表达量低于对照组，TLR4相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 病例组与对照组miR-140-3p、TLR4相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of relative expression levels of miR-140-3p and TLR4 between case group and control group

表1 病例组与对照组miR-140-3p、TLR4相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of relative expression levels of miR-140-3p and TLR4 between case group and control group

注：miR-140-3p=微小RNA-140-3p，TLR4= Toll样受体4

组别 例数 miR-140-3p TLR4对照组 300 0.852±0.165 0.301±0.127病例组 285 0.660±0.198 0.523±0.164 t值 12.766 18.358 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 再狭窄亚组与无再狭窄亚组患者临床资料及支架植入情况比较 再狭窄亚组与无再狭窄亚组患者年龄、性别、BMI、高血压发生率、吸烟率、饮酒率、熬夜者所占比例、TC、TG、LDL-C、HDL-C、CK、CK-MB、TNF-α、IL-6及冠状动脉狭窄支数、支架长度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；再狭窄亚组患者糖尿病发生率、空腹血糖、hs-CRP、PCT、TLR4相对表达量及冠状动脉狭窄率高于无再狭窄亚组，miR-140-3p相对表达量及LVEF低于无再狭窄亚组，支架内径小于无再狭窄亚组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2～3）。

2.3 冠心病患者PCI后支架内再狭窄的影响因素 将表2～3中有统计学差异的指标作为自变量（其中空腹血糖与糖尿病存在明显共线性，剔除检验统计量值较小的空腹血糖，仅保留糖尿病），将支架内再狭窄作为因变量（赋值：无=0，有=1），进行多因素Logistic回归分析，结果显示，糖尿病、PCT及TLR4相对表达量是冠心病患者PCI后支架内再狭窄的危险因素，而miR-140-3p相对表达量、LVEF及支架内径是冠心病患者PCI后支架内再狭窄的保护因素（P＜0.05，见表4）。

表2 再狭窄亚组与无再狭窄亚组患者人口学特征、合并症、生活习惯及实验室检查指标比较Table 2 Comparison of demographic characteristics，complications，living habits，laboratory examination indexes between restenosis subgroup and nonrestenosis subgroup

表3 再狭窄亚组与无再狭窄亚组患者影像学资料及支架植入情况比较Table 3 Comparison of imaging data and stent implantation between restenosis subgroup and non-restenosis subgroup

表4 冠心病患者PCI后支架内再狭窄影响因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

2.4 PCT和miR-140-3p、TLR4相对表达量及LVEF对冠心病患者PCI后支架内再狭窄的预测价值 PCT和LVEF是冠心病患者的常规监测指标。ROC曲线分析结果显示，miR-140-3p、TLR4相对表达量预测冠心病患者PCI后支架内再狭窄的AUC与PCT比较，差异无统计学意义（Z值分别为0.139、1.307，P值分别为0.889、0.121）；但高于LVEF，差异有统计学意义（Z值分别为6.634、6.669，P值均＜0.001，见表5、图1）。

表5 PCT和miR-140-3p、TLR4相对表达量及LVEF对冠心病患者PCI后支架内再狭窄的预测价值Table 5 Predictive value of PCT，miR-140-3p relative expression level，TLR4 relative expression level and LVEF in predicting in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

3 讨论

图1 PCT和miR-140-3p、TLR4相对表达量及LVEF预测冠心病患者PCI后支架内再狭窄的ROC曲线Figure 1 ROC curve for PCT，miR-140-3p relative expression level，TLR4 relative expression level and LVEF in predicting in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

冠心病是临床上最常见的心血管疾病之一，其病理基础为冠状动脉粥样硬化导致管腔狭窄或闭塞，进而引起心肌缺氧缺血性损伤。既往研究表明，冠心病的发生、发展受到多方面因素影响，且相关因素之间又存在交互影响，其中炎性反应、斑块破裂及血栓形成是冠心病的三大病理机制，且三者之间紧密联系、相互促进，共同推动病情进展，如炎性反应可促进细胞和血小板黏附，诱导斑块形成并促进斑块破裂，而斑块破裂反过来又促进了栓子形成，并与栓子共同加剧了炎性反应［7］。近年，ISNA理论的提出进一步揭示了炎性反应在冠心病发生发展中的重要作用，也使免疫炎性反应在PCI后支架内再狭窄中的介导作用受到更多重视。TLR是人体固有免疫应答中的主要成员之一，在免疫防御和炎症应答中发挥着重要作用，其中TLR4与核转录因子κB（NF-κB）组成的TLR4/NF-κB信号通路可通过调节炎性反应和细胞凋亡过程而参与冠心病的病理进程［8-9］。因此，本研究以TLR4为切入点，寻找与冠心病患者PCI后支架内再狭窄相关的生物标志物。

miRNAs是一类含有17～25个核苷酸、高度保守的小分子非编码RNA，其广泛存在于病毒、植物及高等哺乳动物中，是最大的基因家族之一。在功能方面，miRNAs虽然不具有编码蛋白质的作用，但可以通过与靶基因结合而沉默靶基因表达，抑制其下游信号通路活性［10］；此外，miRNAs还可以通过外泌体实现细胞间信号传递，参与细胞间信息交流［11］。现有研究证实，部分miRNAs在维持内皮细胞稳定性和保护心肌细胞方面发挥着重要作用，是心血管疾病的潜在生物标志物［12-13］。与CRP、TNF-α等炎性递质不同，miRNAs在循环系统中具有高度稳定性，因此其又被认为是一种理想型生物标志物。miR-140-3p是TLR4的上游miRNAs，两者呈负调控关系。刘静等［14］研究表明，miR-140-3p对冠心病不良心血管事件具有预测价值，提示miR-140-3p与冠心病病理机制有关。

本研究结果显示，病例组患者miR-140-3p相对表达量低于对照组，TLR4相对表达量高于对照组；再狭窄亚组患者miR-140-3p相对表达量低于无再狭窄亚组，TLR4相对表达量高于无再狭窄亚组，提示血液循环中miR-140-3p、TLR4表达可能与冠心病及ISNA有关；本研究进一步进行多因素Logistic回归分析结果显示，糖尿病、PCT及TLR4相对表达量是冠心病患者PCI后支架内再狭窄的危险因素，而miR-140-3p相对表达量、LVEF及支架内径是冠心病患者PCI后支架内再狭窄的保护因素，与既往研究支持的糖尿病、PCT促进PCI后支架内再狭窄发生，LVEF高、支架内径大利于预防PCI后支架内再狭窄发生的结论一致［15-16］。既往研究表明，TLR4异常升高增加了PCI后支架内再狭窄发生风险［17-18］。但目前国内外关于miR-140-3p与PCI后支架内再狭窄关系的研究报道少见。PCT和LVEF是冠心病患者的常规监测指标。本研究ROC曲线分析结果显示，miR-140-3p、TLR4相对表达量预测冠心病患者PCI后支架内再狭窄的AUC分别为0.866、0.798，与PCT（0.862）相当，但高于LVEF（0.531），提示血液循环中miR-140-3p、TLR4表达对冠心病患者PCI后支架内再狭窄具有一定预测价值。

综上所述，血液循环中miR-140-3p和TLR4表达是冠心病患者PCI后支架内再狭窄的影响因素，且二者对冠心病患者PCI后支架内再狭窄的预测价值较高，可作为预测冠心病患者PCI后支架内再狭窄的生物标志物。

作者贡献：冯六六进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、结果分析与解释，负责撰写及修订论文；冯六六、史骏、刘天华、刘新兵、单蓉进行数据收集、整理、分析；白艳艳负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。