基于微阵列技术筛选原发性高血压病伴左心室肥厚患者长链非编码RNA差异表达谱研究

黄园，王巧竹，张文倩，牛小麟，3，高登峰

【Abstrac】 Background The molecular study of myocardial remodeling related genes can provide new ideas and methods for the early diagnosis and treatment of left ventricular hypertrophy（LVH）.Although long noncoding RNAs（lncRNAs）do not encode any proteins，but they can regulate gene expression at multiple levels.Objective To analyze the differential expression profile of lncRNAs in essential hypertension patients with LVH by using microarray technology.Methods A total of 86 patients with essential hypertension admitted to the Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University from April to November 2017 were randomly selected，and they were divided into LVH group（n=43）or NLVH group（n=43）according to left ventricular mass index（LVMI）.Another 43 healthy volunteers matched with gender and age of patients with essential hypertension in the same hospital were recruited as the healthy control group.The differentially expressed lncRNAs in plasma were performed by microarray technology within three patients of each group；the relative expression of lncRNA in the rest patients in three groups were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（q-PCR）.The coding noncoding gene co-expression（CNC） analysis was performed for the differentially expressed lncRNAs，and the gene ontology（GO）analysis and pathway analysis were performed on the related mRNAs of significantly differentially expressed lncRNAs.Results Compared with healthy control group and NLVH group，the relative expression of RP11-327F22.4 in LVH group was increased by 15.162 and 19.437 times，respectively（P＜0.05）；and the relative expression of KHSRPP1 was down regulated by 7.132 and 5.062 times，respectively（P＜0.05）.q-PCR results showed that the relative expression of RP11-327F22.4 in LVH group and NLVH group was higher than that in healthy control group，and it was higher in LVH group than that in NLVH group（P＜0.05）.Furthermore，the relative expression of KHSRPP1 in LVH group and NLVH group was lower than that in healthy control group，while it was lower in LVH group than that in NLVH group（P＜0.05）.CNC analysis indicated that 29 coding protein genes co-expressed with KHSRPP1 and 13 coding protein genes co-expressed with RP11-327F22.4 were found（correlation coefficient≥0.8，P≤0.05，FDR≤1）.GO analysis showed that mRNAs associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 were mainly involved in the activations of G-protein coupled peptide receptor and polypeptide receptor.Furthermore，the mRNAs associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 were mainly involved in cell activation and response to wounding in the biological process.Whilst，the mRNAs associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 were mainly rich in cell plasma membrane or periphery of cells.Pathway analysis discovered that mRNAs associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 were mainly concentrated in neuroactive ligand-receptor interaction and calcium signaling pathway.Conclusion RP11-327F22.4 and KHSRPP1 are lncRNA differentially expressed in plasma of essential hypertension patients with LVH，and both of them may be potential targets for the prevention and treatment of essential hypertension with LVH.

高血压是引起左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）的主要原因。研究表明，LVH是心脑血管疾病的独立危险因素，而逆转LVH可以降低心脑血管事件发生率［1］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNAs）是转录本长度超过200 nt但缺乏蛋白质编码功能的一类RNA的总称［2］，尽管其没有编码功能，但却能以RNA的形式在转录、转录后及表观遗传等多个层面参与基因表达的调控［3］。本研究以lncRNAs为切入点，采用微阵列技术，分析原发性高血压病伴LVH患者lncRNAs差异表达谱及可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2017年4—11月西安交通大学第二附属医院心内科住院部收治的原发性高血压病患者86例，根据左心室质量指数（LVMI）分为左心室肥厚组（LVH组）和无左心室肥厚组（NLVH组），每组43例。另选取同期本院与原发性高血压病患者性别、年龄相匹配的体检健康者43例作为健康对照组。三组患者性别、年龄、24 h血压、体质指数（BMI）、空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、尿酸、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；LVH组患者高血压病程长于NLVH组，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组患者脑钠肽（BNP）比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。本研究经西安交通大学第二附属医院医学伦理委员会审核批准，所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 基因芯片筛选 采集所有受试者外周静脉血3 ml，常温静置20 min，之后3 000 r/min离心10 min（离心半径3 cm），留取血浆，采用Trizol试剂将血浆中的总RNA提取后冻存。每组选取3例患者（要求一般资料匹配）的总RNA标本，按试剂盒步骤将总RNA生成带有标记探针的cRNA，并将其与LncPathTM人心血管芯片进行杂交、扫描及分析，筛选差异表达的lncRNAs，该步骤由康成生物有限公司完成。

表1 三组患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information in the three groups

1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（q-PCR） 提取三组剩余患者的总RNA标本并检测其质量及纯度，合格后利用特异性反转录方法将提取到的总RNA作为模板反转录合成特异性cDNA，最后采用q-PCR方法检测差异基因相对表达量。

1.4 生物信息学分析 对筛选出的lncRNAs进行编码-非编码基因共表达（coding-noncoding，CNC）分析，然后将与其关联的mRNA进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析和Pathway分析，该步骤由康成生物有限公司完成。

1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因芯片筛选结果 LVH组与健康对照组比较，血浆中差异表达的lncRNAs共51条，其中上调17条、下调34条；NLVH组与健康对照组比较，血浆中差异表达的lncRNAs共25条，其中上调6条、下调19条；LVH组与NLVH组比较，血浆中差异表达的lncRNAs共18条，其中上调11条、下调7条。与健康对照组、NLVH组比较，LVH组RP11-327F22.4相对表达量分别上调15.162、19.437倍（P＜0.05），KHSRPP1相对表达量分别下调7.132、5.062倍（P＜0.05，见表2）。

2.2 q-PCR结果 q-PCR结果显示，三组RP11-327F22.4、KHSRPP1相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；LVH组和NLVH组RP11-327F22.4相对表达量高于健康对照组，LVH组RP11-327F22.4相对表达量高于NLVH组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LVH组和NLVH组KHSRPP1相对表达量低于健康对照组，LVH组KHSRPP1相对表达量低于NLVH组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1）。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 CNC分析 CNC分析结果显示，共挑出29种与KHSRPP1共表达的蛋白质编码基因，13种与RP11-327F22.4共表达的蛋白质编码基因（相关系数≥0.8，P≤0.05，FDR≤1），见图2（高清彩图见OSID码）。

2.3.2 GO分析 GO分析结果显示，与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在分子功能层面主要富集在G蛋白偶联受体（GPCR）的激活与多肽受体的激活，见图3。与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在生物学过程层面主要富集在细胞激活和损伤的修复，见图4。与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在细胞组成层面主要富集在细胞周围与细胞膜，见图5。

图1 三组RP11-327F22.4、KHSRPP1相对表达量比较Figure 1 Comparison of relative expression of RP11-327F22.4 and KHSRPP1 in the three groups

表2 lncRNAs差异表达谱Table 2 Differential expression profile of lncRNAs

（续表2）

图2 与KHSRPP1和RP11-327F22.4有关的蛋白质编码基因共表达网络图Figure 2 Co-expression network of protein coding genes associated with KHSRPP1 and RP11-327F22.4

图3 与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在分子功能层面的富集分数图Figure 3 Enrichment fraction map of correlation of mRNA associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 at molecular function level

2.3.3 Pathway分 析 Pathway分析结果显示，与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA主要富集在刺激神经组织的配体-受体相互作用路径与钙离子相关的信号路径，见图6。

3 讨论

心肌重构与多种基因改变有关，因此从分子功能层面对心肌重构相关基因进行研究可为心肌重构的早期诊断及治疗提供新的思路与方法，但目前高血压引发LVH的分子机制尚不清楚，依然是临床面临的巨大挑战。

图4 与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在生物学过程层面的富集分数图Figure 4 Enrichment fraction map of correlation of mRNA associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 at biological process level

图5 与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在细胞组成层面的富集分数图Figure 5 Enrichment fraction map of correlation of mRNA associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1 at cellular component level

图6 与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA的pathway分析富集分数图Figure 6 Enrichment fraction map of pathway analysis of mRNA associated with RP11-327F22.4 and KHSRPP1

lncRNAs是一类具有高度组织与疾病特异性的非编码RNA，目前其是肿瘤和心血管疾病的研究热点并已成为肿瘤和心血管疾病诊断和治疗的有效工具［4-5］。尽管lncRNAs没有蛋白质编码功能，但其却参与了许多重要监管机制如转录干扰与激活、核内运输、X染色体修饰、基因组印记、染色体沉默等［6］，因此其在多个层面（如表观遗传层面、转录层面和转录后）发挥了调控基因表达的作用，而了解基因调控机制和作用有助于了解心脏相关疾病的发生和发展。2014年，GAO等［7］报道了心血管转录组复合体是由RNA编辑、RNA剪接和非编码RNA组成，而非编码RNA增加了心肌基因表达调控网络的复杂性，揭示了针对病理应激具有的潜在调节方式，也证明了重新对心脏相关疾病提出新的诊断及治疗方法是可行的。

目前认为血浆中lncRNAs来源于细胞凋亡、坏死，细胞的主动释放或循环细胞的裂解。内源性lncRNAs分子常会与蛋白质结合形成复合体，从而避免被酶分子降解，故能稳定存在于血浆和尿液中。lncRNAs在室温条件下能稳定保持24 h，且反复冻融也不会影响其稳定性［8］。LI等［9］研究表明，lncRNAs在心肌组织、全血甚至正常血浆中的表达与其核酸长度均呈负相关，但心力衰竭患者血浆中lncRNAs表达与其核酸长度无关联，提示血浆lncRNAs的出现并不是心肌组织对心力衰竭的被动反应，也不是从心肌组织中渗漏出来的，可能是由于血细胞或胚胎造血干细胞的激活产生的。因此，分析血浆中lncRNAs的类别及含量可作为疾病诊断的一种非侵入性方法［10］。

微阵列技术（如lncRNAs芯片或测序技术）使研究不同疾病状态下lncRNAs的表达差异成为可能，且为后续lncRNAs的功能研究及标志物筛选提供了一个较为便捷的平台。lncRNAs异常转录、表达、调控及结合蛋白可能在许多重要疾病（如肿瘤及心血管疾病）的发生中发挥着至关重要的作用［11-12］，但这仍需要进一步探索、证实。

本研究结果显示，RP11-327F22.4和KHSRPP1是原发性高血压病伴LVH患者血浆中差异表达显著的lncRNA，且二者均与多种蛋白质编码基因有关联。既往研究表明，蛋白质编码基因FGF10可通过FOXO3/p27kip1调控胎儿心肌细胞增殖并触发成年人心肌细胞重新进入细胞周期，是心脏修复的潜在目标［13］；FGF10/FGFR2b信号通路是心肌纤维化的重要通路，能影响心肌的生长和发育［14］；蛋白质编码基因KLF2可通过调节心血管重要基因而参与内皮细胞间质转化的调控［15］；蛋白质编码基因FGF1可通过与Fn14相互作用而介导心肌细胞进入再循环［16］。本研究通过GO分析结果发现，与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关的mRNA在生物学过程层面上主要富集在细胞激活及损伤的修复，而LVH是一种病理修复过程，因此RP11-327F22.4和KHSRPP1很有可能参与心肌重塑的调控；而与RP11-327F22.4和KHSRPP1相关联的mRNA在分子功能层面主要富集在GPCR的激活与多肽受体的激活，而血管紧张素Ⅱ 1型受体（AT1R）是一种7次跨膜的GPCR，其过度激活可导致心肌肥大及纤维化，在心肌重构过程中发挥着重要作用［17］。

综上所述，RP11-327F22.4和KHSRPP1是原发性高血压病伴LVH患者血浆中差异表达显著的lncRNA，二者均可能成为预防和治疗原发性高血压病伴LVH的潜在靶点；但RP11-327F22.4和KHSRPP1在原发性高血压病伴LVH中的具体调节通路及可能机制仍需进一步探究。

作者贡献：黄园、牛小麟、高登峰进行文章的构思与设计；黄园、高登峰进行研究的实施与可行性分析、论文的修订；黄园进行数据收集、整理、分析，并撰写论文；黄园、王巧竹、张文倩进行结果分析与解释；高登峰负责文章的质量控制及审校；牛小麟对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。