牛至细胞悬浮培养合成多酚及黑曲霉诱导子的促进作用

李燕平，刘 媛，王小强，沈倍韵，周香菊，赵文佳，陈继光,，尹忠平,

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045；2.南开大学 药物化学生物学国家重点实验室，天津 300350）

牛至（Origanum vulgare）为唇形科牛至属多年生草本植物[1]，又名山薄荷、野荆芥、五香草，主要分布于我国的新疆、甘肃、湖北等省区以及地中海地区、北非、北美等地[2]。牛至中含有具有独特香味、抗菌消炎活性的香荆芥酚、百里香酚等挥发性成分[3]，可广泛用于饮料、食用香料、食品防腐剂、饲料添加剂等[4-6]。除挥发油外，牛至还富含多酚、三萜和甾醇等非挥发性活性成分，其中迷迭香酸是牛至多酚类物质的主要成分。迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫和改善记忆等多方面的生理活性[7-8]。Kikuzaki等[9]从牛至叶片中分离得到了咖啡酸、迷迭香酸和原儿茶酸等5 种多酚类物质，并证实其有很强的抗氧化活性。Farr等[10]研究发现，迷迭香提取物中所含的迷迭香酸可以显著提高SAMP8小鼠的学习和记忆能力。Rocha等[8]通过体外和体内实验证实，迷迭香酸具有很好的抗氧化和抗炎能力。因此，牛至中迷迭香酸等多酚类物质具有很好的开发利用前景。

以植物的根、茎、叶、花、果实等为原料提取植物次生代谢产物，虽然材料种类多、来源广，但植物生长周期较长，依赖于自然条件，受环境和病虫害的影响较大，同时由于原料成分复杂，纯化的难度较大、成本高；而植物细胞培养生产次生代谢产物具有周期短、可控性强、受自然环境影响小、目标物易于提取和纯化等诸多优点，被认为是一种有巨大潜力的天然产物生产技术[11]。但从目前的研究报道看，植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物还存在产量较低的问题，而通过添加诱导子进行刺激可有效提高目标物的产量，是解决这一问题的较好途径之一[12]。黑曲霉诱导子（Aspergillus nigerelicitor，ANE）是一种能刺激植物和微生物次级代谢产物合成的真菌诱导子，其通过信号转导引起相关基因表达的变化，从而促进多酚类、萜类、生物碱类、黄酮类等特定次级代谢产物的合成[13]。Rajendran等[14]研究表明，ANE和黄曲霉诱导子均可显著促进胡萝卜愈伤组织中花青素的合成。熊琼琼等[15]在青钱柳悬浮培养细胞中添加200 μg/mL的ANE，细胞内总三萜含量提高到49.52 mg/g，为对照组的10.21 倍。Yu Longjiang等[16]发现外源ANE可以提高红豆杉细胞培养体系中紫杉醇合成相关酶的活性，从而显著提高紫杉醇产量。上述研究表明，ANE对植物细胞合成次生代谢产物有较好的促进作用。

本研究以实验室前期建立的牛至细胞悬浮培养体系合成迷迭香酸等多酚类物质，初步鉴定其中的多酚化合物种类，为进一步提高多酚的含量和产量，采用ANE对悬浮培养的牛至细胞进行诱导，研究诱导对迷迭香酸等多酚合成的影响，旨在为牛至细胞培养生产多酚提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛至悬浮培养细胞由江西省天然产物与功能食品重点实验室提供；黑曲霉（CGMCC3.0453）购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

MS（Murashige and Skoog）培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Tieda试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TripleTOF5600＋超高效液相色谱-飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-TOF-MS/MS）仪美国ABSciex公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent科技有限公司；SW-CJ-ICU洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；ZHWY-3222回旋振荡摇瓶机美国惠普公司；V-5600紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；SY-360超声波提取仪 上海宁商超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至细胞悬浮培养

选取生长状态良好的牛至悬浮培养细胞，重新接种到新的MS液体培养基中培养。培养条件：MS培养基添加3.0 mg/L激动素、0.5 mg/L二氯苯氧乙酸和30 g/L蔗糖，置于含有250 mL培养液的500 mL三角瓶中进行振荡光培养，接种量（鲜细胞质量/培养液体积）为15 g/100 mL，培养pH值为5.8±0.2，温度（28±1）℃，转速120 r/min，每10 d继代一次。

1.3.2 细胞生长曲线的绘制

参照Liu Zebo等[17]方法。选取生长迅速、性状稳定、活力高的10 d龄悬浮培养细胞，筛网过滤后，称取6 g接种于装有40 mL MS液体培养基的100 mL三角瓶中，其他培养条件同1.3.1节，培养16 d，每2 d收获一次，烘干称质量。以干质量（g）为纵坐标、收获时间（d）为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3.3 细胞生物量的测定

将悬浮培养细胞进行真空抽滤后，置于50 ℃恒温烘箱中烘干至质量恒定，称量得干质量。

1.3.4 细胞活力的测定

参照刘泽波[18]方法，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）法。称取洗涤后的悬浮细胞200 mg，放入试管，加入0.1% TTC溶液（用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液配制成pH 7）5 mL，置于22 ℃恒温箱中染色26 h。取出吸去TTC液，用重蒸馏水漂洗2～3 次后，加入5 mL 95%乙醇溶液，置于60 ℃水浴中孵育30 min，待细胞完全无色后，离心，取上清液在490 nm波长处测定吸光度，吸光度越大，则细胞活力越强。

1.3.5 细胞总多酚的提取

准确称取1 g牛至悬浮培养细胞粉末于试管中，加入20 mL 50%甲醇溶液，在50 ℃恒温条件下超声辅助提取50 min，提取液4 000 r/min离心10 min，收集上清液，低温避光保存，备用。

1.3.6 总多酚含量测定

采用福林-酚比色法，参照朱仙慕等[19]的方法，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，所得回归方程y=0.010 6x＋0.016 9 （y为吸光度，x为没食子酸质量浓度（μg/mL）），检测范围为20～120 μg/mL，R2为0.999 2。总多酚含量以每克牛至悬浮培养细胞（干质量）样品中没食子酸当量（mg）表示。

1.3.7 HPLC及UPLC-TOF-MS/MS检测条件

将1.3.5节制得的样品溶液，经0.45 μm的有机滤膜过滤，备用。标准品均用50%甲醇溶液溶解，经0.45 μm的有机滤膜过滤，备用。

HPLC检测条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～40 min，5%～37.5% A、95%～62.5% B；40～45 min，37.5%～5% A、62.5%～95% B）；检测波长327 nm。

U P L C-TO F-M S/M S 检 测 条 件 ： U P L C 条 件 ：流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～40% A、95%～60% B；20～30 min，40%～95% A、60%～5% B；30～32 min，95% A、5% B；32～35 min，95%～5% A、5%～95% B），检测波长327 nm。MS/MS条件：采用负离子模式；毛细管电压3 500 V；质量扫描范围m/z50～1 250；雾化气压力40 psi；干燥气流速10 L/min；干燥气温度350 ℃；碰撞电压120 V。

1.3.8 迷迭香酸含量测定

采用HPLC法进行测定，具体条件如1.3.7节所示。以迷迭香酸标准品绘制标准曲线，得回归方程y=10 989x＋7.712 4（y为吸光度，x为迷迭香酸质量浓度（μg/mL）），检测范围为25～400 μg/mL，R2为0.999 4。迷迭香酸含量以每克牛至悬浮培养细胞（干质量）样品中迷迭香酸当量（mg）表示。

1.3.9 ANE的制备

参照熊琼琼[15]的方法，取振荡培养7 d的成熟黑曲霉菌丝，置于十字研磨器中，添加适量磷酸盐缓冲液（pH 6.0）进行研磨匀浆，4 000 r/min离心10 min；取上层悬浊液，121 ℃灭菌30 min，即得ANE。ANE质量浓度以总糖含量计，以葡萄糖为标准，采用蒽酮-硫酸比色法进行测定。

1.3.10 诱导参数单因素试验设计

ANE质量浓度：牛至悬浮培养细胞处理、培养条件同1.3.2节，培养至第10天时分别添加质量浓度为25、50、100、200 μg/mL的ANE，空白对照组加入等体积的缓冲液（pH 6.0），继续培养2 d后收获细胞。

ANE添加时间：牛至悬浮培养细胞处理、培养条件同1.3.2节，分别在指数生长初期（第8天）、指数生长中期（第10天）、指数生长末期（第12天）添加50 μg/mL的ANE，空白对照组在相同时间点加入等体积的缓冲液（pH 6.0），均在添加诱导子后继续培养2 d收获细胞。

ANE持续作用时间：牛至悬浮培养细胞处理、培养条件同1.3.2节，待其生长至第10天时加入50 μg/mL的ANE，每组均设置空白对照，空白对照组均在相同时间点加入等体积的缓冲液（pH 6.0），持续作用1、2、3 d后收获细胞。

1.3.11 优化诱导参数的验证实验

牛至悬浮培养细胞处理、培养条件同1.3.2节，采用单因素试验得出的最佳条件，测定其生物量、总多酚和迷迭香酸的含量及产量，设置空白对照组，空白对照组加入等体积的缓冲液（pH 6.0），每组均设置3 个平行。

1.4 统计分析

数据采用Origin和SPSS软件进行统计分析，每次实验均设置3 次重复，数据结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 牛至悬浮培养细胞的生长特性

如图1所示，牛至悬浮培养细胞生长曲线总体呈典型的“S”型，与文献报道的青钱柳[20]、黄栀子[17]细胞悬浮培养生长曲线基本相似。为期16 d的生长周期大致可以划分为4个阶段：迟滞期（0～8 d）、指数生长期（8～12 d）、稳定期（12～14 d）及衰退期（14～16 d）。当牛至悬浮培养细胞刚接种到新的培养环境中时，需要一定时间适应新环境，因此有一个较长的生长迟滞期，此时细胞生长缓慢；当细胞逐渐适应了新的培养环境，开始迅速增殖，进入指数生长期（8～12 d），4 d时间内细胞生物量从8.5 g/L迅速提高到19.00 g/L；第12天为细胞生物量最大时间点，此时细胞呈浓密状态，且无褐化现象；14 d后细胞逐渐衰亡，生物量逐渐下降，出现较明显褐化现象。

图1 牛至悬浮培养细胞生长曲线Fig. 1 Growth curve of suspension-cultured O. vulgare cells

2.2 牛至悬浮培养细胞多酚的合成特征

图2 牛至细胞总多酚含量和产量Fig. 2 Content and yield of polyphenols in suspension-cultured O. vulgare cells

如图2所示，在为期16 d的生长周期中，总多酚含量大致呈“一”字型，而其产量走势大致和生长曲线相似呈典型的“S”型，且均在第12天达到峰值，分别为9.58 mg/g、182.08 mg/L。在生长周期的前8 d，细胞总多酚含量基本维持在同一水平，但其产量逐渐增加；培养8～12 d，总多酚含量呈现小幅增加的趋势，可能此期间是细胞多酚的合成期；培养12 d后，细胞逐渐衰亡，总多酚含量和产量也逐渐下降。综合分析牛至细胞生长曲线和多酚的积累量可知，在整个生长周期中，总多酚含量一直维持在相对较低水平，其产量也相对较低，且其产量的提高大部分是由生物量引起的而非含量。目前的研究表明，ANE诱导是提高植物细胞次生代谢物含量的有效手段。杜坤玉[21]用黑曲霉粗提物处理虎杖愈伤组织，发现其白藜芦醇含量显著提高。刘泽波等[22]在青钱柳悬浮培养细胞中加入200 μg/mL ANE 10 h后，三萜含量提高到了36.46 mg/g，为对照组的3.36 倍。因此，后续进行ANE诱导研究，以进一步提高牛至细胞总多酚含量。

2.3 牛至悬浮培养细胞多酚类物质的鉴定

2.3.1 HPLC分析

图3 牛至细胞提取物的PLC图Fig. 3 HPLC chromatograms of the extract from O. vulgare cells

由图3可知，在本实验所采用的检测方法和条件下，样品溶液中的各色谱峰得到了较好分离，表明其中的化合物分离度较好，可以采用此条件进行后续的检测和分析；细胞提取物检测色谱图中主要有7 个色谱峰，为了确定这7 个色谱峰所代表的物质，结合UPLC-TOF-MS/MS进行进一步检测和分析。

2.3.2 UPLC-TOF-MS/MS分析

在HPLC检测的基础上，进一步采用UPLC-TOF-MS/MS对牛至悬浮细胞提取物中的多酚类物质进行鉴定，UPLC图和总离子流图如图4所示，各物质二级质谱图见图5。在UPLC-TOF-MS/MS检测图谱中，保留时间为1.25 min处有一个较高的峰，通过对比其与样品制备所用溶剂的一级、二级质谱信息，推断为溶剂峰而非次级代谢产物峰。

图4 UPLC（a）和总离子流图（b）Fig. 4 UPLC chromatogram (a) and total ion current chromatogram (b)

图5 UPLC-TOF-MS/MS测定牛至细胞多酚类物质Fig. 5 Detection of polyphenols from suspension-cultured O. vulgare cells by UPLC-TOF-MS/MS

1号峰的保留时间为2.81 min，其分子离子峰[M－H]－为m/z315.073 3，与原儿茶酸和己糖形成的糖苷类化合物的分子质量相吻合。在其二级质谱中，出现了m/z152.013 6、153.020 5、108.025 4和109.032 5的特征碎片离子（图5a），与Karar等[23]所鉴定的原儿茶酸-O-己糖苷的质谱检测数据基本相符。因此，初步推断1号峰为原儿茶酸-O-己糖苷。

2号峰的保留时间为3.98 min，其分子离子峰[M－H]－为m/z299.114 6，二级质谱中有59.021 6、119.054 5、71.019 2和137.067 0等特征碎片离子（图5b），参照文献[24]推断2号峰为红景天苷。细胞多酚提取物加入红景天苷标准品后进行HPLC检测，结果表明红景天苷标准品与2号峰出峰时间一致，加标后的峰面积相应增大，峰形左右对称。因此，推断2号峰为红景天苷。

3号峰的保留时间为4.78 min，其质谱信息与Karar等[23]等通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法鉴定山楂中所含的水杨酸-O-葡糖苷的质谱信息基本一致，其[M－H]－为m/z299.078 5，二级质谱中有m/z93.038 9和137.026 5这两个主要碎片离子峰（图5c）。因此，推断3号峰为水杨酸-O-葡糖苷。

4、5、6号峰的保留时间分别为10.074、11.598 min和12.438 min，其分子离子峰m/z分别为521.129 7、359.082 0和373.093 4，二级质谱中均有m/z161.02、135.04、179.03、197.04这些特征碎片离子峰。研究表明，迷迭香酸分子离子峰为[M－H]－为m/z359.08，二级质谱主要碎片离子峰为m/z161.02、135.04、179.04、197.04[25]。因此，推断这3 个化合物为迷迭香酸及其衍生物。5号峰的二级碎片主要有161.025 7、133.031 4、135.045 9、179.035 7和197.046 0（图5e），其质谱信息与Parejo等[25]所鉴定的迷迭香酸检测数据基本一致，推断5号峰为迷迭香酸。通过加入迷迭香酸标准品进行HPLC检测，确证5号峰为迷迭香酸。4号峰和6号峰的二级碎片还分别有323.077 2、359.082 0、521.129 7（图5d）和175.041 0（图5f），通过与Yang Yimin[26]和Abedini[27]等报道的质谱信息进行比对，推断4号峰为迷迭香酸-3-O-葡糖苷，6号峰为迷迭香酸甲酯。

保留时间为6.8 min的色谱峰，其分子离子峰为m/z221.047 8，二级质谱特征碎片峰的m/z77.045 9、133.068 5、55.027 9、159.047 0、131.052 4，尚未发现类似的质谱检测数据报道，因此目前还无法做出判断，有待于进一步鉴定。

2.4 ANE质量浓度对细胞生长和多酚积累的影响

2.4.1 ANE质量浓度对细胞生长的影响

由图6可知，在设定的质量浓度范围内添加ANE，细胞生物量无显著性差异，细胞活力基本保持在同一水平，说明添加25～200 μg/mL ANE对细胞的生长不会产生显著影响。当ANE质量浓度低于200 μg/mL时，所收获细胞的外观形态和颜色与对照组相比基本没有差异，均呈淡黄白色；当ANE质量浓度为200 μg/mL 时，细胞发生了轻微的褐化，细胞颜色加深，呈淡黄褐色（图7a）。较高质量浓度的ANE处理会导致细胞发生一定程度的褐化，这与李萍等[28]的研究报道相似。为了观察ANE诱导作用下悬浮培养细胞在微观形态上的变化，在倒置显微镜下观察了不同ANE质量浓度处理下的细胞形态（图7b），发现在设定范围内，ANE诱导对细胞的微观形态基本没有影响，细胞均为圆形或椭圆形，大多数细胞聚集成10 个细胞左右的细胞团。Yin Zhongping等[20]在研究青钱柳细胞生长的研究中表明，单细胞和过大的细胞聚集体均不利于细胞生长，最适合青钱柳细胞生长的细胞聚集体大小为10～80 个细胞。

图6 不同质量浓度AN作用下的细胞生物量及细胞活力Fig. 6 Biomass and viability of the harvested cells under the elicitation of ANE at different concentrations

图7 AN作用下细胞外观（a）和显微镜下的细胞形态（b）Fig. 7 ANE-elicited cells (a) and its morphology observed under inverted microscope (b)

2.4.2 ANE质量浓度对细胞多酚积累的影响

由图8可知，随着ANE质量浓度的增加，细胞总多酚和迷迭香酸（细胞中的代表性多酚化合物）的含量和产量均呈现出先升后降的趋势，大致呈倒“V”字形，均在50 μg/mL时达到最高峰值；细胞总多酚的峰值含量和产量分别为26.21 mg/g、485.00 mg/L，分别增加了1.67 倍和1.83 倍；迷迭香酸的峰值含量和产量分别为18.55 mg/g、336.77 mg/L，分别增加了2.24 倍和2.37 倍。在悬浮培养的牛至细胞中，迷迭香酸是多酚中的主要成分，其占总多酚比例在58.35%～76.76%之间，ANE对细胞多酚合成的促进作用主要体现在促进迷迭香酸的合成上。综合分析细胞生物量、总多酚含量和产量的变化规律可知，ANE诱导牛至悬浮培养细胞合成多酚的作用效果是通过提高细胞内迷迭香酸等多酚物质的含量实现的，而非细胞生物量。刘冉[29]在以茉莉酸甲酯诱导红松细胞多酚合成的研究中发现，1.00～2.50 μmol/L茉莉酸甲酯处理组与对照组相比，原花青素积累量没有显著差异；当浓度为5.00、10.00 μmol/L时，原花青素含量显著高于对照组；而高浓度（20.00～40.00 μmol/L）处理则显著降低了原花青素的积累量，其诱导实验结果与本研究基本一致。

图8 不同质量浓度AN作用下牛至细胞迷迭香酸、总多酚的含量和产量Fig. 8 Contents and yields of rosmarinic acid and polyphenol in O. vulgare cells under the elicitation of ANE at different concentrations

2.5 ANE添加时间对细胞生长和多酚积累的影响

2.5.1 不同时间点添加ANE对细胞生长的影响

图9 不同时间点添加AN作用下细胞生物量（A）和细胞活力（B）Fig. 9 Biomass (A) and viability (B) of cells under the elicitation of ANE added at different times

在指数生长初期添加ANE对牛至悬浮细胞的生长有轻微的抑制作用，此时细胞生物量下降为对照组的94%；在指数生长中期和末期添加诱导子对细胞的生长基本没有影响，ANE诱导组的细胞生物量大致与对照组细胞生物量持平（图9A）。细胞活力检测结果（图9B）表明，随着时间的推移，细胞活力呈逐渐下降的趋势；在不同的时间点添加诱导子，ANE组细胞活力与对照组细胞活力基本一致，说明添加50 μg/mL ANE不会抑制细胞活力。此外，在指数生长期添加诱导子对细胞的外观形态没有影响，培养瓶中均有细胞挂壁，细胞培养物呈现浓稠膏状，真空抽滤后的细胞颗粒均一、呈细砂状（图10）。

图10 第10天添加50 诱导作用2 d后的细胞Fig. 10 Cells elicited for 2 days by ANE added on the 10th day

2.5.2 不同时间点添加ANE对细胞多酚积累的影响

图11 不同时间点添加AN作用下迷迭香酸、总多酚的含量（a）和产量（b）Fig. 11 Contents (a) and yields (b) of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of ANE with different addtion times

有研究表明，在迟滞期添加诱导子会抑制次生代谢产物的合成，而在稳定期添加诱导子对细胞几乎没有刺激效果，因为此时培养基中营养成分基本被消耗完，细胞已经停止生长；只有指数生长期最适于诱导，此时细胞生长旺盛、活力最强，对营养物质的消耗最快，次生代谢产物合成相关酶的表达量最高，添加诱导子往往能达到最佳刺激效果。何梦玲等[30]分别在广藿香悬浮细胞生长的第0、7、9、13天时加入1 mg/L水杨酸进行诱导，发现在第9天（指数生长初期）添加诱导效果最好。王莹[31]对培养至第9～11天的红豆杉细胞进行诱导，发现在指数期添加诱导子能迅速、显著提高次生代谢产物合成的相关信号强度，细胞对刺激最敏感，且不同时期诱导产生效应的机制也不同。结合2.1节和2.2节研究结果可知，牛至细胞指数生长期是多酚的合成期，因此本研究选择细胞指数生长初、中、末期3 个不同时间点添加ANE以促进牛至细胞多酚的合成，图11表明，在指数生长期的不同时间点添加50 μg/mL ANE进行诱导时，对细胞合成多酚的刺激效果差别很大。在细胞指数生长初期和中期添加诱导子，细胞总多酚的积累量显著提高，含量分别提高了1.43 倍和1.76 倍，其中迷迭香酸含量分别提高了1.51 倍和2.27 倍，而在指数生长末期添加诱导子基本上没有促进作用，ANE诱导组细胞总多酚含量与对照组大致相同。

综合分析诱导子对牛至细胞的生长和总多酚积累的影响可知，在指数生长中期（第10天）添加ANE，对多酚合成的诱导效果最好，此时总多酚产量达到485.00 mg/L，提高了1.80 倍，其中迷迭香酸产量占70.12%，达到340.08 mg/L，是对照组的3.27 倍。因此，细胞指数生长中期为添加ANE的最佳时间点。

2.6 ANE持续作用时间对细胞生长和多酚积累的影响

图12 不同AN作用时间下细胞生物量、细胞活力（a）和添加AN作用2 d后的细胞液外观（b）Fig. 12 Biomass and viability of cells under the elicitation of ANE for different durations (a) and cells elicited by ANE for 2 days (b)

诱导子作用1～3 d，诱导组的细胞生物量和细胞活力与对照组没有显著差异（图12a），添加50 μg/mL ANE对细胞生长没有显著影响。此外，诱导子作用时间的长短对细胞培养物的外观形态没有显著影响（图12b），但ANE作用时间对细胞合成多酚的影响较为显著（表1）。随着作用时间的延长，细胞总多酚含量和产量呈先上升后下降的趋势。当作用时间为2 d时，ANE对细胞合成多酚的促进效果最好，此时总多酚含量提高了1.62 倍，产量为480.38 mg/L；其中迷迭香酸含量提高了2.28 倍，产量达到353.25 mg/L。因此，ANE诱导的最佳作用时间为2 d。Zhao Jian等[32]研究也表明，如果诱导子处理时间太短，诱导效果不明显，但时间过长则可能会抑制次生代谢产物合成并造成细胞死亡。

表1 AN不同作用时间下迷迭香酸、总多酚的含量和产量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

表1 AN不同作用时间下迷迭香酸、总多酚的含量和产量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

时间/d 指标 迷迭香酸 总多酚对照组 ANE组 对照组 ANE组作用1 含量/（mg/g） 5.82±0.12 13.19±0.95 10.03±0.26 20.82±1.19产量/（mg/L） 98.94±2.29 224.23±8.91 170.51±3.59 353.94±10.54 2 含量/（mg/g） 5.74±0.21 18.84±1.24 9.79±1.07 25.62±1.07产量/（mg/L） 107.63±2.24 353.25±10.28 183.56±2.55 480.38±10.39 3 含量/（mg/g） 5.78±0.11 16.02±1.23 11.21±1.04 23.85±1.04产量/（mg/L） 112.71±2.38 312.39±9.74 218.60±2.57 465.08±10.88

2.7 ANE优化诱导条件的验证

对优化的ANE诱导条件进行验证，结果表明，优化诱导条件下（即在第10天添加50 μg/mL ANE，持续作用2 d后收获细胞），ANE诱导组细胞的迷迭香酸含量和产量分别为对照组的3.25 倍和3.33 倍，总多酚含量和产量分别为对照组的2.83 倍和2.90 倍（表2），与前述实验结果基本一致，表明ANE诱导确实能有效地促进细胞合成多酚。孙思琳等[33]研究了硫化氢对白桦悬浮细胞多酚积累的影响，结果表明经硫化氢处理后，细胞多酚含量为2.70 mg/g，是对照组的1.37 倍；刘冉等[34]分别以60、80 μmol/L茉莉酸甲酯和水杨酸诱导红松细胞，松多酚的含量分别增加了7.23 mg/g和14.68 mg/g；与上述研究结果相比，牛至细胞经ANE诱导后多酚含量和产量都处于更高水平，说明ANE对牛至细胞合成多酚具有更加显著的诱导效果，因此具有较好的应用前景。

表2 优化后的AN诱导作用条件下牛至悬浮细胞迷迭香酸和总多酚的含量及产量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

表2 优化后的AN诱导作用条件下牛至悬浮细胞迷迭香酸和总多酚的含量及产量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

总多酚产量/（mg/L）ANE组 0.76±0.02 19.02±0.28 27.16±0.78 361.38±8.77 516.04±10.23对照组 0.74±0.03 5.86±0.12 9.61±0.19 108.41±9.11 177.79±2.97组别 生物量/（g/40 mL）迷迭香酸含量/（mg/g）总多酚含量/（mg/g）迷迭香酸产量/（mg/L）

3 结 论

以牛至细胞悬浮培养合成多酚，通过UPLC-TOFMS/MS鉴定了该细胞中原儿茶酸-O-己糖苷、红景天苷、水杨酸-O-葡糖苷、迷迭香酸-3-O-葡糖苷、迷迭香酸和迷迭香酸甲酯6 种多酚类物质；50 μg/mL ANE可显著促进牛至细胞多酚的合成，诱导后总多酚的含量和产量分别增加了1.83 倍和1.90 倍，其中迷迭香酸含量和产量分别增加了2.25 倍和2.33 倍。