3种霍山产石斛茎HPLC指纹图谱对比研究

杨秀容, 孟海涛, 李强明, 罗建平

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

安徽霍山主产霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)、铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)、细茎石斛(Dendrobiummoniliforme)3种石斛,均为兰科石斛属草本植物[1-2]。《本草纲目拾遗》中记载石斛“清胃除虚热,生津已劳损”[3],石斛可用于阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕、病后虚热、目暗不明,是一种名贵的中药材,茎是石斛主要药用部位[4-6]。石斛主要有多糖、生物碱、黄酮类、氨基酸、微量元素等多种活性成分[7-11],正是这些组分使其可以发挥保肝、降血糖、抗氧化、抗肿瘤等作用,但3种石斛的功效却有明显差异,其中霍山石斛最佳[12-17]。3种石斛的形态在新鲜茎上有差异,干燥后的枫斗制品形态相似,不易区分,因此市场上常出现使用铁皮石斛、细茎石斛来冒充霍山石斛进行销售的现象。为更好地区分3种霍山产石斛,本研究通过对全年12个月的3种霍山产石斛茎的甲醇提取物进行高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)分析以建立指纹图谱,通过对HPLC指纹图谱进行对比研究以发现3种霍山产石斛茎的化学成分变化规律及差异,为区分和鉴别3种霍山产石斛提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器、柱温箱、四元泵),JK-300DVB型三频数控超声波清洗器(合肥金尼克机械制造有限公司),AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),VAPML旋转蒸发仪(德国Heidolph公司),XT5118-OV140电热鼓风干燥箱。

1.2 实验材料

3种石斛采收于霍山县太平畈乡王家店村霍山石斛种植基地,由合肥工业大学食品与生物工程学院罗建平教授鉴定,从1—12月份每月采收1次,霍山石斛样品记为A1～A12,铁皮石斛样品记为B1～B12,细茎石斛样品记为C1～C12。

色谱级乙腈、色谱级甲醇(美国 TEDIA 试剂公司),色谱级乙酸(上海凌峰化学试剂有限公司),超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

称取不同月份3种石斛茎粉末(过80目筛)0.400 0 g,置于100 mL三角瓶中,加入 20 mL甲醇超声溶解,上清液浓缩蒸干,加入甲醇溶解定容至 2 mL,摇匀过0.22 μm有机滤膜,备用。

1.3.2 色谱条件

色谱条件参考文献[18],具体如下:色谱柱为Agilent C18(150×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈、0.1%乙酸,洗脱梯度(0～10 min、30%乙腈;10～20 min、35%乙腈; 20～40 min、55%乙腈;40～45 min、70%乙腈;45～90 min、100%乙腈);检测波长为270 nm;流速为0.8 mL/min;柱温为35 ℃;上样量为20 μL。

2 结果与分析

2.1 3种石斛指纹图谱的建立

将石斛样品A1～A12、B1～B12、C1～C12按供试品溶液的制备方法制备,将制成的供试品进行色谱检测分析,提取样品在270 nm处的色谱图。可以得到霍山石斛、铁皮石斛、细茎石斛3种石斛12个月的石斛茎指纹图谱,如图1所示。

图1 3种石斛茎的12个月指纹图谱比较

根据各样品指纹图谱中各色谱峰的保留时间,选取峰形较好且分离度较高的17个峰作为研究色谱的指纹峰。这17个峰在3种石斛相应位置均有出现,各色谱峰的平均保留时间见表1所列。

表1 17个共有峰保留时间

2.2 相似度分析

本文分别将3种石斛样品所得到的茎的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A(国家药典委员会),结果发现7月份指纹图谱峰形较好、分离度较高、且较为稳定,因此选择作为参照。分别以A7、B7、C7样品色谱图作为对照,计算相应对照图谱与样品图谱的相似度数据,霍山石斛12个月的茎指纹图谱相似度在0.979～0.999之间,铁皮石斛12个月的茎指纹图谱相似度在0.986～0.999之间,细茎石斛12个月的茎指纹图谱相似度在0.457～0.992之间。结果表明,不同采收期的霍山石斛和铁皮石斛茎化学成分均具有比较好的稳定性,而不同采收期的细茎石斛茎所含的化学成分和质量有一定的区别。

2.3 3种石斛茎指纹图谱分析

3种石斛指纹图谱标定了17个共有峰,为了比对3种石斛指纹图谱在各个月份间的差异性,用色谱峰面积来表示峰强度,将3种石斛的17个色谱峰在各个月份间的色谱峰强度差异进行比较,如图2所示。

图2 3种石斛茎的12个月17个共有峰的强弱分析

从图2可看出,1～3月份细茎石斛的1号峰含量很低,铁皮石斛的16号峰含量很低。在4月份,霍山石斛的6、16号峰含量相对较高,而铁皮石斛和细茎石斛的6、16号峰含量很低。在5月份,铁皮石斛的6、16号峰含量依然很低,霍山石斛6号峰含量大于细茎石斛。在6月份,霍山石斛的2、6号峰含量相对较高,细茎石斛的16号峰含量较高。在8月份,霍山石斛2号峰含量很高,铁皮石斛的8号峰含量很低,同时在16.55 min处细茎石斛出现了明显的特征峰。在8月份,霍山石斛的2、6、16号峰的含量均高于另外2种石斛,同时铁皮石斛的2、6号峰含量比细茎石斛高。在9月份,细茎石斛的1、2、6号峰峰值均高于铁皮石斛,而霍山石斛的1号峰含量较低，而2、6号峰含量则相对较高。在10月份,细茎石斛1号峰含量很高,铁皮石斛次之,霍山石斛的1号峰含量最低;霍山石斛的6号峰含量较高,铁皮石斛次之,而细茎石斛6号峰的含量最低。在11月份,细茎石斛在8.12 min处存在特异性色谱峰,霍山石斛的6号峰含量比铁皮石斛和细茎石斛高,铁皮石斛16号峰含量比霍山石斛和细茎石斛高。在12月份,在1号峰的含量上,铁皮石斛最高,细茎石斛次之,霍山石斛最低;在6号峰的含量上,霍山石斛最高,细茎石斛次之,铁皮石斛最低;在16号峰的含量上,霍山石斛最高,细茎石斛次之,铁皮石斛最低。根据3种石斛茎12个月指纹图谱中17个共有峰的峰强度比较发现，3种石斛的1、2、6、8、16号共有峰峰强度差异显著,细茎石斛在8.12、16.55 min 处存在特征色谱峰。

3 结 论

本实验对3种石斛茎HPLC指纹图谱进行对比研究,标定了17个共有峰,相似度分析表明，不同月份的霍山石斛和铁皮石斛茎化学成分具有比较好的稳定性,而不同月份的细茎石斛茎所含的化学成分和质量有一定的区别。3种石斛茎指纹图谱存在显著差异,主要表现在共有峰峰强度和特征色谱峰上,将1、2、6、8、16号共有峰与8.12、16.55 min 处色谱峰组合可对3种石斛进行有效的鉴别,为3种石斛的区别和鉴定提供了新的方法和途径。