丹膝颗粒HPLC 指纹图谱的建立

刘灿黄，何清彦，吴胜男，林丽美，夏伯候，黄胜

1.长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.九芝堂股份有限公司，湖南 长沙 410205

丹膝颗粒原名“偏瘫灵颗粒”，收载于《中国药典》2020年版一部［1］，为九芝堂独家生产品种，临床上对阴虚风动型和气虚血淤型中风偏瘫有其特有的预防和治疗优势［2-4］。全方由丹参、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、生地黄、淫羊藿、桑寄生、栀子、决明子、火麻仁12 味药材组成，丹膝颗粒原质量标准建立了丹参、牛膝、淫羊藿、栀子、决明子的薄层色谱鉴别和丹酚酸B、天麻素的高效液相含量测定方法，薄层色谱和含量测定项目多而且前处理方法繁杂，影响因素较多。目前尚没有文献报道有关丹膝颗粒指纹图谱的研究，本研究通过高效液相色谱法，DAD 检测器和ELSD 检测器两个检测器串联［5-6］，建立丹膝颗粒HPLC-DAD-ELSD 双通道指纹图谱，较为直观、简单呈现丹膝颗粒整体化学成分，为科学评价及有效控制丹膝颗粒的质量提供可靠方法。

1 仪器与试药

岛津LC-20AD 高效液相色谱仪，SPD-M20A检测器，ELSD-LT Ⅱ蒸发光散射检测器；SIL-20A自动进样器，LCsolution 色谱工作站，电子天平METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超声仪。

对照品及对照药材：没食子酸（批号：110831-201906，91.5%），栀子苷（批号：110749-201718，97.6%），丹酚酸B（批号：110562-201917，96.6%），淫羊藿苷（批号：110737-202017，98.1%），丹皮酚（批号：110708-201908，99.8%），丹参酮ⅡA（批号：110766-202022，98.9%），芍药苷（批号：110736-201943，95.1%），丹参素（批号：20101，99.3%），人参皂苷Ro（批号：20051，96.0%），橙黄决明素（批号：20031，98.0%），丹参（批号：120923-201816），牡丹皮（批号：121490-201603），丹参素、人参皂苷Ro、橙黄决明素对照品购自珠海安哲生物科技有限公司，其余对照品、对照药材均购自中国食品药品检定研究院，试剂甲醇、甲酸为分析纯，水（超纯水），乙腈（色谱纯）。丹膝颗粒（规格：每袋装10 g）15批样品由九芝堂股份有限公司提供，按照药典标准项目检验合格。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液精密称取没食子酸、栀子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹参酮ⅡA对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.05 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的对照品溶液1。精密称取丹参素、芍药苷、人参皂苷Ro、橙黄决明素对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.10 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的对照品溶液2。

2.1.2 供试品溶液样品研细，取粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定重量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）45 min，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 对照药材溶液按处方量及制备工艺，依照“2.1.2”项下的方法进行处理，分别制备丹参、牡丹皮对照药材溶液。

2.2 色谱条件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～65 min，5%→30%A；65～120 min，30% →90%A；120～121 min，90%→5%A；121～135 min，5%A）；流速：0.8 mL/min；柱温35 ℃，进样量10 μL，分析时间135 min，DAD（190 nm～400 nm）检测；ELSD 条件：漂移管温度45 ℃，气体流量1.5 L/min，增益9。色谱图见图1。

图1 HPLC-DAD-ELSD色谱图

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样测定6 次，分别测得DAD、ELSD下各共用峰保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下0 h、15 h、30 h、45 h、60 h、75 h、90 h 依次测定，分别测得DAD、ELSD 下各共用峰保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.0%，表明供试品溶液90 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验取同一批号样品6 份，依照“2.1.2”项下的方法进行处理，在上述色谱条件下依次测定，分别测得DAD、ELSD 下各共用峰保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 共有峰归属取对照品溶液1、对照品溶液2依法进样测定，记录色谱图，与指纹图谱各主要峰对比，标示17 个共有峰，DAD 检测器下1 号峰为没食子酸、2 号峰栀子苷、3 号峰丹酚酸B、4 号峰淫羊藿苷、5 号峰丹皮酚、9 号峰丹参酮ⅡA，ELSD检测器下11 号峰为丹参素，13 号峰为芍药苷，16号峰为人参皂苷Ro，17 号峰为橙黄决明素。通过参考丹参对照药材溶液和牡丹皮对照药材溶液色谱图，6 号峰、7 号峰、8 号峰为丹参脂溶性成分，12号峰、14 号峰，15 号峰为牡丹皮中成分，10 号峰未知，具体化合物需进一步质谱确认。2 号峰栀子苷、3 号峰丹酚酸B、4 号峰淫羊藿苷及9 号峰丹参酮ⅡA在ELSD 下同样有较强检测信号，但其紫外吸收明显，故选用DAD（254 nm）下标识检测，在ELSD 检测器下未标识。色谱图见图1。

2.4.2 指纹图谱建立及相似度分析取15批次样品各适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）进行分析，建立双通道串联指纹图谱（参考图谱：S1，对照图谱生成方法：中位数，时间窗宽度：0.1 min），生成对照图谱，多点校正法建立指纹图谱，指纹图谱、对照指纹图谱见图2、图3。共标示17 个共有峰，DAD 检测器（254 nm）下相似度在0.961～0.998，ELSD 检测器下相似度在0.965～0.999。15批样品相似度整体分布均在0.95 以上，表明相似度良好。

图2 HPLC-DAD-ELSD指纹图谱：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

图3 HPLC-DAD-ELSD对照指纹图谱：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

3 讨论

3.1 DAD 检测波长和ELSD 检测的选择

实验通过DAD 检测器200～400 nm 全波段扫描，分析色谱结果时分别比较了芍药苷、栀子苷、淫羊藿苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA等成分的最大吸收波长处（如210 nm、230 nm、238 nm、254 nm，270 nm，286 nm，320 nm）下整体样品峰信息，最后选择波长254 nm 下样品整体检测信号丰富、灵敏度较高，便于整体评价。DAD 检测器下对没食子酸、栀子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹参酮ⅡA等10 个成分进行了标识检测，为进一步加强对丹膝颗粒质量的整体控制，弥补在DAD 检测器下有些成分含量低、紫外吸收不明显的缺点［7］，选择样品从DAD 检测器检测流出后再进入ELSD 检测器同步检测，ELSD 检测器下标识人参皂苷Ro、橙黄决明素等6 个共有峰。

3.2 供试品溶液制备、流动相系统、流动相比例的选择

考察了不同提取溶剂（50%甲醇，70%甲醇，100%甲醇）；不同提取方法（超声45 min，回流提取30 min，回流提取1 h）。以100%甲醇提取、超声45 min 时，方法较简单且目标成分提取率较高，提取完全，各检测信息相对稳定，分离效果较好。流动相体系考虑了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液［8-10］。其中加0.05%甲酸溶液和0.05%磷酸溶液均优于纯水体系，因考虑用ELSD检测器，选择了易挥发的0.05%甲酸溶液；因样品中成分极性范围宽，有些成分出峰时间慢，成分多且复杂，故最终选择乙腈-0.05%甲酸溶液流动相，分离度相对较好且基线平稳。并对流动相比例进行了优化［11-15］，最终按照“2.2”项下梯度洗脱的流动相比例。

3.3 指纹图谱分析

本研究指纹图谱17 个共有峰分别为1 号峰没食子酸、2 号峰栀子苷、3 号峰丹酚酸B、4 号峰淫羊藿苷、5 号峰丹皮酚、9 号峰丹参酮ⅡA、11 号峰丹参素、13 号峰芍药苷、16 号峰人参皂苷Ro、17 号峰橙黄决明素，以上成分分别来源于丹参、赤芍、牡丹皮、栀子、淫羊藿、牛膝、决明子。6、7、8 号峰分别来源于丹参，12、14、15 号峰分别为来源于牡丹皮。共有峰的相对保留时间稳定，方法学考察精密度、稳定性、重复性均符合要求，相似度结果符合要求。

本研究为生产企业对丹膝颗粒的整体年度质量回顾、监管部门对丹膝颗粒整体质量监控、科学评价丹膝颗粒的整体质量提供参考方法。