伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤5例临床和细胞病理学检查分析

杨 巧，温玉婷，杨昌伟

（1.空军军医大学西京医院a.病理科，b.急诊科，陕西 西安 710032；2.西安市第九医院病理科，陕西 西安 710054）

恶性黑色素瘤是一种较少见且进展快速的侵袭性肿瘤，其恶性程度高，易发生转移[1]。转移以局部淋巴结转移最为常见，也可远处转移至皮肤、肺、肝、骨骼、胃肠系统和大脑[2]。伴浆膜腔积液为表现的黑色素瘤极为罕见，目前国内外文献少有报道[3]。本研究回顾性分析了自2008年6月至2020年3月间我院收治的5例经浆膜腔积液细胞学检查诊断为恶性黑色素瘤的病例，探讨伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤患者的临床和病理学特征以及诊断、鉴别诊断方法。

资料与方法

一、资料

回顾分析空军军医大学西京医院2008年6月至2020年3月间收治的5例经浆膜腔积液细胞学检查诊断为恶性黑色素瘤的病例，收集其临床资料，包括性别、年龄、既往病史、临床表现、随访及预后。

二、方法

1.常规细胞涂片及染色：将送检的浆膜腔积液标本（送检量均＞100 mL）静置于4 ℃冷藏冰箱中过夜，待次日标本自然沉降分层后，用吸管吸取细胞较多的底部沉淀10 mL，置于塑料离心管中，平衡后以600g离心10 min，弃去上清液后，用吸管吸取分层处标本，均匀涂抹于2张玻片上，一张在潮干的情况下置于95%乙醇与无水乙酸混合液中固定，另一张自然干燥。取潮干固定的涂片行常规苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，自然干燥的涂片则行瑞氏-吉姆萨特殊染色。

2.细胞蜡块的制作：将常规细胞学检查剩余的标本移入2个50 mL离心管，然后以600g离心10 min，吸取或直接倒掉上清液，将2管沉渣并入同一个离心管中，倒入95%乙醇固定液，再行600g离心30 min，用擦镜纸包裹沉渣后进行常规脱水、包埋、切片及HE染色。沉渣较少的标本可加入少量伊红试剂以便识别。

3.免疫细胞化学染色：采用EnVision两步法（Vantanna全自动免疫组织化学染色仪）进行免疫细胞化学染色，所用一抗包括HMB45、S-100、Pan-mel、SOX10、波形蛋白、AE1/AE3、CR、D2-40、CD68、甲状腺转录因子1（thyroid-transcription-factor-1,TTF-1）、CK7均购自福州迈新生物技术开发有限公司。所有操作过程均按说明书进行，同时设立阳性对照。

结果

一、临床资料

5例经浆膜腔积液细胞学检查诊断为恶性黑色素瘤的病例中，男性2例，女性3例，发病年龄为30～71岁，平均为48.6岁。本组3例为胸腔积液，2例为腹腔积液；3例的积液为浅红色，1例为棕黄色，1例为灰黄色。5例患者既往均有恶性黑色素瘤病史，病例3患者右手拇指远节切除活检标本行BRAF基因体细胞突变检测，结果并未检测到BRAF基因第15号外显子突变。病例5于外院行淋巴结活检病理学检查，结果证实为转移性恶性黑色素瘤，其BRAF基因突变检测结果为野生型。4例患者自初次确诊至出现浆膜腔积液，病程为5个月至5年。本研究对患者进行随访，至2020年4月，1例失访，另4例患者的随访时间为2～11个月，其中3例死亡，1例存活（见表1）。

二、细胞病理学检查

3例患者的胸腔积液、2例患者的腹腔积液行常规细胞涂片检查，并行HE染色和瑞氏-吉姆萨特殊染色。在显微镜下观察细胞涂片，可见肿瘤细胞形态较为一致，肿瘤细胞聚集成团、成片或散在分布（见图1A）；肿瘤细胞为中等大小，呈上皮样形态；细胞质丰富或中等（见图1B）；细胞核大小不等，核膜不规则，染色质粗糙，可见嗜酸性大核仁（见图1C）；部分肿瘤细胞胞质内可见不等量的色素颗粒（见图1D）。

表1 5例伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤患者的临床资料

图1 常规细胞涂片（HE染色）

图2 例2患者的左侧胸腔积液离心、包埋细胞蜡块免疫细胞化学染色（×200）

例2、例3、例4患者的浆膜腔积液标本经离心、包埋处理获得细胞蜡块，并行免疫细胞化学染色，结果显示，肿瘤细胞呈HMB45（3/3）阳性（见图2A）、S-100（2/3）阳性、Pan-mel（3/3）阳性（见图2B）、SOX10（1/2）阳性、波形蛋白（3/3）阳性，AE1/AE3、CR、D2-40、CD68、TTF-1、CK7均呈阴性。

对浆膜腔积液标本涂片进行细胞形态学观察，以及离心、包埋细胞蜡块及免疫细胞化学染色，结果均支持恶性黑色素瘤的诊断（见表2）。

讨论

一、伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤的临床特征

浆膜腔积液见于各种疾病，包括心力衰竭、感染、恶性肿瘤和创伤。浆膜腔积液的颜色、性状对疾病的诊断有一定提示意义。不同疾病产生的浆膜腔积液，外观颜色可不同，淡黄色、透明、比重低的浆膜腔积液常见，多提示漏出液；而渗出液可能为各种颜色且色深、比重大，如黄色、红色（血性）以及白色、绿色等。区分漏出液与渗出液有助于缩小临床鉴别的诊断范围。

恶性黑色素瘤是一种快速进展的侵袭性肿瘤，恶性程度高，易发生转移。多数病例肿瘤可转移至肺，也可累及皮下组织、淋巴结、骨骼和肝脏[4]。然而，转移性恶性黑色素瘤引起浆膜腔积液较为少见。文献报道，仅有2%的胸腔转移性恶性黑色素瘤患者出现胸腔积液，外观可呈现为黑色胸腔积液[5]。

文献中有关黑色胸腔积液也少有涉及和讨论。Saraya等[6]讨论了黑色浆膜腔积液形成的可能原因和需鉴别的疾病，提出了以下4种原因。①黑曲霉和米根霉相关的感染；②恶性黑色素瘤（肿瘤细胞胞质富含黑色素）；③非小细胞肺癌或胰腺假性囊肿破裂相关的出血和溶血；④其他原因，包括含木炭的脓胸、可卡因吸入细胞内或细胞外黑色素运输通过脏层胸膜。本研究报道了5例经浆膜腔积液细胞学检查诊断为恶性黑色素瘤的病例，其中3例为胸腔积液，2例为腹腔积液；3例积液为浅红色，1例为棕黄色，1例为灰黄色。

二、伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤细胞的病理学特征

出现浆膜腔积液的恶性黑色素瘤患者，由于积液标本中肿瘤细胞形态多样，呈透明细胞、大小不等的上皮样形态细胞、梭形肉瘤样细胞均可出现，少见情况下还可出现印戒样细胞，故采用积液标本进行细胞学检查来诊断具有一定难度。多数情况下，肿瘤细胞为单个、散在分布，聚集的瘤细胞团也很常见；肿瘤细胞以单个核为主，染色质粗糙、可见显著大的嗜酸性核仁；肿瘤细胞质内可见不等量的色素颗粒，而富含棕色色素颗粒的肿瘤细胞是导致黑色浆膜腔积液的原因，具有一定的诊断提示意义。值得注意的是，大约20%的恶性黑色素瘤不含色素。

表2 5例伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤细胞病理学检查及免疫细胞化学染色结果

HMB45、Pan-mel和S-100是恶性黑色素瘤诊断常用的免疫组织化学染色标志物。最近文献报道，SOX10可作为浆膜腔积液细胞学诊断恶性黑色素瘤的标志物[7]。此外，文献报道肿瘤细胞BRAF V600K突变检测也可用于诊断浆膜腔积液转移性恶性黑色素瘤[8]。本研究报道的5例经浆膜腔积液细胞学检查诊断为恶性黑色素瘤的病例均为回顾性研究，由于包埋蜡块收集肿瘤细胞成分少，未进行BRAF基因突变检测，其中病例3、病例5患者的肿瘤组织活检行BRAF基因突变检测，结果均为阴性。

三、鉴别诊断

细胞病理学诊断浆膜腔积液恶性黑色素瘤，需要与以下几种疾病鉴别。

1.转移性腺癌：转移性腺癌是恶性浆膜腔积液最为常见的病因，该病肿瘤细胞多呈团排列，三维立体结构明显。少数情况下，在转移性肺腺癌引起的胸腔积液及胃肠道转移性低分化腺癌引起的腹腔积液中，肿瘤细胞呈单个散在分布，呈高核质比、异型性显著，需与恶性黑色素瘤进行鉴别。检测相应的免疫标志物 （肺腺癌AE1/AE3、CK7、TTF-1、Napsin A呈阳性，胃肠道转移性低分化腺癌CK20、CDX-2呈阳性）将有助于鉴别。

2.淋巴瘤：浆膜腔淋巴瘤多为非霍奇金淋巴瘤，在细胞学涂片中表现为细胞成分单一，涂片背景中间皮细胞、炎细胞、组织细胞成分较少，主要为大量散在分布的不成熟淋巴样细胞，细胞间无黏附性，肿瘤细胞呈圆形，细胞质少，核质比高，染色质呈颗粒状，而细胞质中有无色素颗粒、免疫组织化学LCA（CD45/白细胞共同抗原）阳性及恶性黑色素瘤特异性标志物HMB45、Pan-mel和S-100阴性均有助于两者间的鉴别诊断。

3.恶性间皮瘤：该肿瘤细胞多呈团分布，并呈腺样、花环状排列，细胞形态温和，细胞质丰富，免疫组织化学CR、D2-40、MC、AE1/AE3阳性有助于鉴别诊断。

四、治疗及预后

转移性恶性黑色素瘤患者预后极差，10年生存率低于10%[9]，故及时、准确地对伴浆膜腔积液的恶性黑色素瘤患者进行细胞学诊断十分重要。结合患者的既往病史，详细进行临床检查、浆膜腔积液的细胞学形态观察及免疫细胞化学染色有助于该病的诊断和鉴别诊断。

有关浆膜腔积液转移性恶性黑色素瘤的治疗，我院常用浆膜腔注射药物加全身治疗的方案，常用化疗药物有替莫唑胺、紫杉类、铂类等。最近相关文献报道，免疫抑制剂Nivolumab这种程序性细胞死亡（蛋白）-1（programmed death-1，PD-1）抑制剂，可用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌的治疗[10]。此外，靶向治疗联合BRAF抑制剂（vemurafenib）和MEK抑制剂（cobimetinib）也被证实，可明显提高恶性黑色素瘤患者的无进展生存期[11]。上述2种方案目前尚没有在我国患者中治疗的循证医学证据和应用经验，而本文报道病例数有限，PD-1及BRAF基因突变检测及相关抑制剂的治疗效果评估还有待收集更多病例行进一步研究。