化学发光免疫分析法检测血浆肾素、醛固酮在原发性醛固酮增多症诊断中的价值

程艾邦，李明轩，陈 波，曹 晟，蒋塨豪，许建忠，李 燕，王继光

(上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科 上海市高血压研究所，上海 200025)

原发性醛固酮增多症（以下简称原醛）是继发性高血压的常见病因之一[1]。在高血压专科就诊的高血压患者中，约8%患有原醛；在难治性高血压患者中，这一百分比高达15%左右[2]。与原发性高血压患者相比，即使处于相同的血压水平，原醛患者的靶器官损伤也更严重[3]，心血管事件的发生率也更高，其非致死性心肌梗死的风险升高5.5倍，脑卒中的风险升高3倍，房颤的风险升高11倍[4]。采用肾上腺外科手术或醛固酮受体拮抗剂等药物治疗原醛，不仅能降低患者的血压，减少降压药物的使用，而且还可缓解高醛固酮负荷造成的心肾功能损害[2]。因此，在高血压患者中，进行原醛的筛查及诊断十分重要。

根据我国高血压患者的原醛患病率为5%～10%推算，我国的原醛患者数量可能多达1 000万～2 000万。尽管如此，目前在高血压患者中确诊原醛的百分比仍较低。原因之一是原醛筛查需要检测血浆醛固酮浓度、肾素浓度或活性，计算其醛固酮/肾素（浓度）比值（aldosterone to renin ratio，ARR），但采用传统的手动放射免疫分析法检测醛固酮浓度及肾素活性耗时、费力。这当中，尤其是肾素活性检测，为提高检测灵敏度，需要延长血浆与底物的反应时间，导致检测的灵敏度及检测效率无法兼顾，因此限制了该检测方法在原醛筛查中的应用。近年来，直接检测肾素浓度的化学发光免疫分析法日趋成熟，不仅可以明显缩短检测时间，还可提高检测的灵敏度。目前，直接肾素浓度检测法正不断改进中，化学发光免疫分析法测得的肾素浓度能否取代肾素活性检测作为一线检测方法，仍需进一步行研究验证。本研究拟分析化学发光免疫分析法检测肾素、醛固酮浓度的准确性，同时比较该检测方法与酶联免疫吸附试验法、放射免疫分析法检测结果间的一致性和诊断效能。

资料与方法

一、资料

本研究分为如下3个部分收集资料。第一部分为探索性研究，初步评估化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附试验法检测肾素浓度、放射免疫分析法检测肾素活性间的一致性。本研究收集2016年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科门诊采用放射免疫分析法检测肾素活性的20例患者血浆样本，用化学发光免疫分析法及酶联免疫吸附试验法复测肾素浓度，评估3种检测方法间的一致性。第二部分研究在2017年4月至6月间进行，将检测样本量扩大至300例来高血压科门诊就诊的患者，比较化学发光免疫分析法测得肾素浓度与放射免疫分析法检测得肾素活性间的一致性。第三部分在前期验证的基础上，进一步完善化学发光免疫分析法与放射免疫分析法检测肾素、醛固酮浓度间的一致性评估，并计算化学发光免疫分析法诊断原醛的ARR阈值。研究样本来自2018年4月至5月间在上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科住院的高血压患者，连续选取125例研究对象进行血浆肾素和醛固酮检测。

本研究纳入患者的标准如下。①年龄≥16岁；②诊室血压≥140/90 mmHg，或平均24 h动态血压≥130/80 mmHg，或既往已确诊为高血压。患者排除标准如下。①高血压病因诊断不明确者；②未留取血标本者。

二、方法

1.血样采集：嘱患者抽血当日站立或行走2 h，静坐15 min后,经肘静脉采血5～6 mL，置于一次性乙二胺四乙酸抗凝管中，分离血浆后用于肾素和醛固酮测定。使用含有酶抑制剂（二巯基丙醇及羟基喹啉硫酸盐）的采血管进行血样采集，用于肾素活性检测，检测肾素活性的血样采集前，需在采血管中加入酶抑制剂，如血样本不能及时送达实验室，则将分离获得的血浆保存在4 ℃～6 ℃恒温冰箱中。门诊采集的血样在进行血浆肾素浓度和肾素活性检测时，化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法及放射免疫分析法共用采血管；病房采集的血样在进行肾素、醛固酮浓度检测时，化学发光免疫分析法分别采用含有和不含有酶抑制剂的2种采血管进行重复采样。

2.肾素、醛固酮检测

（1）化学发光免疫分析法测定血浆肾素及醛固酮浓度：使用LUMO化学发光免疫分析检测仪和配套试剂盒（郑州安图生物工程股份有限公司）进行检测。根据双抗体夹心法原理，检测血浆肾素浓度时，发光强度与其含量成正比；根据竞争法原理，检测血浆醛固酮浓度时，发光强度与其含量成反比。血浆肾素的检测范围为0.5～500.0 pg/mL（1 pg/mL=0.03 pmol/L），其检测下限为0.5 pg/mL，批内变异＜5%，批间变异＜15%；血浆醛固酮的检测范围为5～1 000 pg/mL （1 pg/mL=2.77 pmol/L），检测下限为5.0 pg/mL，批内变异＜6%，批间变异＜9%。

（2）放射免疫分析法测定血浆肾素活性及血浆醛固酮浓度：在上海市内分泌代谢病研究所临床内分泌实验室，采用得到美国病理家协会认可的核素标记免疫检测平台，检测血浆醛固酮浓度，测定下限为3 ng/dL（1 ng/dL=10 ng/L），批内变异＜5%，批间变异＜8%；血浆肾素活性测定试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，检测下限为0.1 ng/（mL·h），批内变异＜10%，批间变异＜15%。

（3）酶联免疫吸附试验法测定血浆肾素浓度：使用美国DRG国际公司肾素酶联免疫吸附试验商品试剂盒进行检测，肾素浓度检测下限为0.80 pg/mL，批内变异＜8.7%，批间变异＜8.9%。

3.原醛的诊断

（1）药物洗脱：对于疑诊原醛的患者，入院前予停用对肾素-血管紧张素系统有较大影响的药物。如螺内酯停用≥6周，其他利尿剂停用≥4周，肾上腺素β 受体阻滞剂、中枢降压药、强效二氢吡啶类钙通道阻滞剂（如硝苯地平、非洛地平等）、甘草制剂和非甾体抗炎药和糖皮质激素类药物等停用≥2周。对于无法停用降压药物的患者，则予换用非二氢吡啶类钙通道阻滞剂（维拉帕米或地尔硫），或肾上腺素α1受体阻滞剂 （特拉唑嗪或多沙唑嗪），或对肾素-血管紧张素系统影响较小的二氢吡啶类钙通道阻滞剂（氨氯地平）降血压。

（2）确诊试验：本研究采用放射免疫分析法检测醛固酮、肾素并计算ARR，对ARR≥240 （pg/mL）/[ng/（mL·h）] 的患者进行原醛确诊试验——静脉生理盐水滴注试验(盐水负荷试验)，阳性者确诊为原醛。盐水负荷试验一般在早晨8：00左右开始，患者在试验开始前先静卧1～2 h，然后静脉滴注生理盐水500 mL/h，连续滴注4 h。滴注前后分别测定血浆醛固酮浓度、肾素活性、血钾和血皮质醇水平。盐水负荷后的血浆醛固酮质量浓度≥60 pg/mL，且肾素活性＜1 ng/（mL·h），判定为盐水负荷试验阳性。

4.血压测量及身高、体重测量：采用电子血压计（欧姆龙HEM-907型）测量患者入院后第1天清晨时段坐位血压，测血压前坐位休息15 min，测右上肢血压，连续测量2次，间隔1 min，取均值。采用经验证的美国Spacelabs公司90207示波法动态血压监测仪，记录24 h动态血压，计算收缩压和舒张压均值。测量身高、体重，计算体质量指数（body mass index,BMI）（kg/m2）。

5.其他实验室检测：所有患者均空腹12 h以上，于次日清晨经肘静脉采血，进行生化检测。采用全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司，CX5PRO SYNCHRON检测系统）检测血清肌酐和电解质等，血清肌酐用酶法测定（BUN Regeant试剂），血清钾采用离子选择电极法。根据慢性肾脏病流行病学合作研究公式计算估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）[5]。

6.统计学分析：数据用SAS 9.4版软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以例数（百分比）表示。不符合正态分布的计量数据经对数转换后再行分析，分别用Student t检验和χ2检验比较组间均数和频率差异。相关性分析采用Pearson方法，采用Bland-Altman方法比较化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附试验法间的肾素检测结果。以原醛确诊试验阳性作为诊断原醛的金标准，绘制受试者操作特征曲线 （receiver operator characteristic curve,ROC曲线），用于评估化学发光免疫分析法诊断原醛的准确率，取约登指数最大时来确定最佳临界值。P＜0.05为有统计学意义。

结果

一、3种方法测得结果间的一致性分析

在纳入研究的20例标本中，放射免疫分析法测得肾素活性的中位值（全距）为3.11 ng/（mL·h）[0.01～8.59 ng/（mL·h）]，而化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附试验法测得的肾素浓度中位值（全距）分别为16.27 pg/mL（0.41～44.09 pg/mL）和17.41 pg/mL（0.16～63.41 pg/mL），其中有1例因肾素浓度过低，用放射免疫分析法和酶联免疫吸附试验法均未能检测出具体数值。

如图1所示，化学发光免疫分析法（r=0.97）、酶联免疫吸附试验法（r=0.98）测得肾素浓度与放射免疫分析法测得肾素活性间均显著相关 （P＜0.001）。采用Bland-Altman分析化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附试验法测得肾素浓度结果间的一致性（见图2），结果显示，化学发光免疫分析法测得的肾素浓度显著低于酶联免疫吸附试验法，2组间的平均差异（±2个标准差）为-（3.08±15.38）pg/mL；进一步分析显示，2种检测方法测得肾素浓度的差值及平均值之间相关系数为-0.87 （P＜0.001），即受试者血浆肾素浓度较高时，化学发光免疫分析法测得值与酶联免疫吸附试验法相比,低估更明显。

图1 化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法与放射免疫分析法检测肾素的相关散点图（n=20）

图2 化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附试验法检测肾素浓度的Bland-Altman图

二、化学发光免疫分析法测得肾素浓度与放射免疫分析法测得肾素活性间的一致性验证

扩大研究样本量，在300例完成肾素活性及浓度检测的血样中，用放射免疫分析法测得的肾素活性中位值（全距）为1.52 ng/（mL·h）[0.01～6.83 ng/（mL·h）]，用化学发光免疫分析法测得肾素浓度中位值（全距）为16.61 pg/mL（0.85～763.58 pg/mL）。如图3所示，自然对数转换的肾素浓度与肾素活性间呈显著正相关（r=0.78，P＜0.001）。

三、化学发光免疫分析法检测肾素、醛固酮筛查原醛的准确率

在125例高血压住院患者中，45例进行了原醛筛查试验，15例经盐水负荷试验确诊为原醛。收集受试者卧位和立位、盐水负荷试验前后的血浆样本，每人检测1～6次，中位次数（全距）为2次，共有300例血浆样本用于肾素以及醛固酮的一致性检测。如图4所示，不论有无酶抑制剂，自然对数转换的化学发光免疫分析法测得肾素浓度与放射免疫分析法测得肾素活性间均显著相关，但相较于有酶抑制剂的肾素检测，无酶抑制剂时测得的肾素浓度与肾素活性间的相关性更强 （0.80比0.67，P＜0.01）。与之类似，化学发光免疫分析法与放射免疫分析法检测的醛固酮浓度显著相关，与有酶抑制剂时测得的醛固酮浓度相比，无酶抑制剂时，2种方法测得血浆醛固酮浓度间的相关性略强，但差异尚无统计学意义（0.83比0.79，P=0.09）。

与原发性高血压患者相比，原醛患者平均24 h动态收缩压/舒张压更高（139.7/90.0 mmHg比128.2/77.8 mmHg，P≤0.01），血清钾浓度更低（3.50 mmol/L比3.97 mmol/L，P＜0.001）。筛查原醛的45例高血压患者平均年龄为（48.4±16.4）岁，有21例（46.7%）为女性，平均诊室血压为137.0/82.1 mmHg，平均24 h动态血压为131.5/81.4 mmHg。采用化学发光免疫分析法测得ARR为1.9～11 600.6 （pg/mL）/（pg/mL），中位值为12.9（pg/mL）/（pg/mL），放射免疫分析法测得的ARR为22.5～11 595.5（pg/mL）/[ng/（mL·h）]，中位值为157.4（pg/mL）/[ng/（mL·h）]（见表1）。

表1 原醛筛查患者的基本参数（n=45）

以盐水负荷试验为诊断金标准，根据化学发光免疫分析法和放射免疫分析法测得的肾素、醛固酮计算ARR，并绘制ROC曲线（见图5）；化学发光免疫分析法测得ARR ≥240（pg/mL）/[ng/（mL·h）]诊断原醛的曲线下面积为0.91，放射免疫分析法测得ARR诊断原醛的曲线下面积为0.95，两者间差异无统计学意义（P=0.21）。

图5 化学发光免疫分析法（ARR≥18.26）与放射免疫分析法（ARR≥240）诊断原醛的ROC曲线

根据约登指数获取化学发光免疫分析法检测ARR诊断原醛的最佳临界值为18.26（pg/mL）/（pg/mL），此时其诊断原醛的灵敏度和特异度均为86.7%（见表2）。

表2 化学发光免疫分析法[ARR≥18.26（pg/mL）/（pg/mL）]诊断原醛的准确率

讨论

本研究采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法及放射免疫分析法检测肾素浓度 （或活性）及醛固酮浓度，比较不同方法测得结果间的一致性，证实如下结果。①化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法测得的肾素浓度与放射免疫分析法测得肾素活性显著相关；②若采用化学发光免疫分析法检测肾素浓度时，使用不含酶抑制剂的乙二胺四乙酸采血管，其测得结果与放射免疫分析法测得肾素活性间的相关性更高；③化学发光免疫分析法在原醛诊断中的准确率与放射免疫分析法相似，基于化学发光免疫分析法ARR≥18.26（pg/mL）/（pg/mL）为诊断原醛的阈值，此时诊断原醛的灵敏度和特异度均为86.7%。

根据2016年欧洲内分泌学会《原发性醛固酮增多症的临床诊疗指南》[2]，2～3级高血压患者、难治性高血压患者及合并低钾血症的高血压患者等均应筛查原醛，这些患者约占全部高血压患者的50%。考虑到高血压患者的原醛患病率高，且这些原醛患者面临更高的心血管风险，故急需寻求一种便捷、准确、快速的方法进行肾素和醛固酮的检测。目前，临床上多采用放射免疫分析法检测肾素活性，根据肾素在设定的pH值和时间内将样本中血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ，然后通过检测血管紧张素Ⅰ水平来间接反映肾素浓度。这一检测方法要求样本在运输过程中予低温存储，检测条件苛刻，耗时较长，对操作技术要求高，限制了其在大规模原醛筛查中的应用。而化学发光免疫分析法检测肾素浓度时，操作简便，耗时短，本研究采用的试剂盒仅需60 min即可完成肾素检测，因此在临床筛查或大规模人群研究中，化学发光免疫分析法检测肾素浓度具有更加广阔的应用前景。

既往已有一些研究报道了化学发光免疫分析法检测肾素、醛固酮浓度的可靠性及诊断原醛的准确率[6-9]，与本研究结果相似。Perschel等[6]较早进行了化学发光免疫分析法与放射免疫分析法检测肾素、醛固酮诊断原醛准确性的研究，该研究共入选了76名血压正常志愿者和28例原醛患者，结果显示，化学发光免疫分析法测得的肾素浓度与放射免疫分析法测得的肾素活性显著相关（r=0.72），2种方法测得的ARR值均可用于区分健康人与原醛患者，2种方法诊断原醛的ROC曲线下面积无差异，化学发光免疫分析法诊断原醛的ARR临界值为43 （pg/mL）/（pg/mL）。但该研究未纳入高血压患者，可能会在一定程度上影响ARR诊断阈值的判定。

近来进行的一项较大样本研究进一步证实了化学发光免疫分析法的检测准确性。该研究纳入147例正常血压者、152例原发性高血压患者和93例原醛患者，结果证实化学发光免疫分析法测的肾素浓度（μIU/mL）与放射免疫分析法测得的肾素活性密切相关，以化学发光免疫分析法测得的ARR≥1.12（ng/dL）/（μIU/mL）作为临界值时，其诊断原醛的灵敏度为98.9%，特异度为78.9%[7]。在日本进行的一项以液相色谱-串联质谱法检测醛固酮为标准的研究中，Morimoto等[8]入选了125例原醛患者和97例高血压患者，评估化学发光免疫分析法与放射免疫分析法检测醛固酮的准确率，结果发现，化学发光免疫分析法及放射免疫分析法测得的醛固酮水平均与液相质谱-串联质谱法检测结果密切相关（r=0.97，r=0.95）。根据ROC曲线获得化学发光免疫分析法诊断原醛的阈值为ARR≥6.0（ng/dL）/（pg/mL），即60（pg/mL）/（pg/mL），此时其诊断原醛的灵敏度为92.0%，特异度为76.3%[8]。

另外，有研究显示，在特定类型的原醛患者中，化学发光免疫分析法可能比放射免疫分析法更具诊断优势[9]。Rossi等[9]在高血压患者中进行原醛筛查研究，同时对原醛患者进行双侧肾上腺静脉取血结合影像学分型来诊断醛固酮腺瘤，结果发现，使用化学发光免疫分析法诊断醛固酮腺瘤的ROC曲线下面积显著大于放射免疫分析法 （0.974比0.894，P=0.02）。

本研究存在一定的局限性。其一，本研究仅比较了化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法以及放射免疫分析法检测肾素、醛固酮结果间的一致性，未与灵敏度、准确率更高的液相色谱-串联质谱法检测结果进行比较。这是考虑到目前指南推荐的原醛筛查ARR阈值仍是基于放射免疫分析法及化学发光免疫分析法[2]，因此本研究未使用液相色谱-串联质谱法作为参考标准。其二，由于本研究用于原醛诊断阈值计算的样本量较小，筛查患者中原醛患者所占百分比较高（33.3%），可能因此导致本研究计算出的ARR诊断阈值偏低[2]。较早研究以肾素活性为计算ARR依据，得出的诊断阈值为240（pg/mL）[ng/（mL·h)][10]，也低于指南推荐的300（pg/mL）/[ng/（mL·h)][11]。

总之，本研究验证了化学发光免疫分析法测定肾素、醛固酮浓度在原醛诊断中的准确性，并提出了化学发光免疫分析法诊断原醛的ARR阈值。这一检测方法因为操作便捷、耗时短，可推广作为血浆肾素、醛固酮浓度检测以及原醛筛查的技术。