一个多发性内分泌腺瘤2A家系的临床特征与基因突变分析

林小云，戚露月,2*，章振林，岳 华

（1.上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病科 上海市骨疾病临床研究中心，上海 200233；2.苏州大学附属第二医院内分泌科，苏州 江苏 215004）

多发性内分泌腺瘤2型 （multiple endocrine neoplasia 2,MEN2）为常染色体显性遗传性疾病，其由Sipple[1]在1961年首先报道，故又被称为Sipple综合征。该病呈家族或散发性发病，发病率约为2.8/10万[2]。临床上，MEN2依据不同表型又可分为MEN2A、MEN2B及家族性甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）3种亚型，其中MEN2A（在线人类孟德尔遗传数据库171400）是最主要的亚型，占所有MEN2病例的55%[3]。目前，国外已报道超过1 000例的MEN2A散发或家系病例[4]，国内共报道80余例散发和90余例家系病例[5-8]。MEN2A患者的临床表现为同时或先后出现2个或大于2个的特定性内分泌腺增生或肿瘤[9]，但因病变出现时间早晚不一而常被漏诊，早期明确诊断MEN2A对患者治疗方式的选择以及遗传干预有重要意义。

本研究对1个MEN2A家系进行临床诊疗分析及致病基因鉴定，并结合相关文献，探讨MEN2A患者的临床表现、诊断以及基因型与表型间的关系，旨在提高临床医师对此类少见内分泌疾病的认识。

资料与方法

一、资料

本研究经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准，家系内所有参与研究的成员均签署知情同意书。

先证者（Ⅱ-3）为33岁的女性，父母为非近亲婚配，其为第三胎第三产，足月顺产，出生时身长、体重与同龄儿相当，既往体健。先证者母亲（Ⅰ-2）与妹妹（Ⅱ-4）在外院被诊断为MTC，分别于55岁和26岁去世，先证者的2个姐姐（Ⅱ-1和Ⅱ-2）均健康，无类似病史（见图1）。

图1 MEN2A家系图

先证者因“骨痛1年余，加重1周”至我科就诊。询问病史，患者自述1年前出现双膝疼痛，1周前出现双髋疼痛，疼痛持续，不能自行缓解，下蹲、起立困难。患者常有便秘，夜间小便7～8次。体格检查示，患者身高157.2 cm，体重38.0 kg，体质量指数为15.38 kg/m2；血压140/80 mmHg，体温36.6 ℃。实验室检查可见血钙、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和降钙素等均升高（见表1）。双能X射线吸收仪（豪洛捷公司，美国）测定第1腰椎至第4腰椎、股骨颈和全髋骨密度Z值分别为-5.4 SD、-5.1 SD和-5.3 SD。患者甲状腺及甲状旁腺B超显示，左侧甲状腺下极背侧见实性低回声肿块，形态不规则，甲状旁腺肿瘤可能；双侧甲状腺多发结节；双侧颈部血管旁可见数个淋巴结。全身核素骨显像结果显示，全身多发骨代谢异常，颅骨弥漫性放射性摄取增高，呈“帽征”，两侧多发肋骨、双侧骶髂关节和双侧股骨对称性放射性摄取增高，考虑为甲状旁腺亢进（甲旁亢）骨病。遂以“多发性内分泌腺瘤”将患者收入外科病房，并行全身麻醉下左侧甲状旁腺肿瘤切除术、左侧甲状腺全部切除术、左侧中央区颈淋巴结清扫术。术后标本经病理检查诊断为左侧MTC（直径0.6 cm）；左侧颈部中央区1枚淋巴结见癌转移；左侧甲状旁腺肿瘤呈多结节性生长，肿瘤有宽带样纤维分隔，局部有包膜浸润，考虑为左侧非典型甲状旁腺腺瘤。免疫组织化学检测结果示，肿瘤细胞内癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、降钙素、突触生长蛋白、CD56和PTH均为阳性，嗜铬粒蛋白A为部分阳性，TG、CK19和半乳凝素3均为阴性，肿瘤细胞增殖指数为2%。术后监测患者的血降钙素、PTH、钙等指标（见表1）。术后常规予患者碳酸钙D3片600 mg每日1次、骨化三醇0.25 μg每日1次治疗。术后4周，先证者的双髋疼痛较前稍缓解，运动功能改善。

表1 先证者术前、术后检查结果

二、方法

1.RET基因突变检测

（1）外周血基因组DNA提取：分别采集先证者（Ⅱ-3）及其二姐（Ⅱ-2）外周血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中。用全血DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技公司)提取血样本DNA，用TU-1900紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）检测DNA浓度。

（2）PCR扩增及突变检测：从在线数据库（Gen-Bank检索号NC_000010）中获得RET原癌基因的DNA序列。引物采用在线Primer 3软件设计（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），共21对，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列参照文献[10]），采用PCR进行外显子扩增。反应体系共20 μL，包括1×PCR预混液缓冲液Ⅰ（TaKaRa公司）9.5 μL，Mg2+（TaKaRa公司）1 μL，dNTP[捷瑞生物工程（上海）有限公司]1 μL，Hotstar Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1 μL，上下游引物各1 μL，超纯水4.5 μL，DNA样本1 μL。PCR反应条件为，预变性95 ℃2 min，变性94 ℃20 s，退火58 ℃～68 ℃（根据不同引物调整）40 s，延伸72 ℃1 min，共35个循环；终端延伸72 ℃2 min。PCR产物经虾碱性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（EXO Ⅰ）（Epicentre公司）纯化后，用美国应用生物系统公司（Applied Biosystems International inc.）（ABI）的BigDye 3.1试剂盒及ABI 3730自动测序仪进行测序。测序文件用PolyPhred软件进行分析，再结合人工校对，记录后整理出结果。

2.致病性及保守性分析：利用在线PolyPhen 2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及 Mutation Master（http：//www.mutationtaster.org/）预测突变位点的致病性，使用UniProt（https：//www.uniprot.org/）软件分析突变氨基酸在不同物种间的保守性。

结果

一、RET基因突变检测

经Sanger法测序发现,先证者的11号外显子发生杂合错义突变c.1901G＞A（见图2），其编码的蛋白质第634位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸（p.Cys634Tyr）。先证者的健康姐姐及300例对照人群未发现上述基因突变位点。

图2 先证者RET基因突变检测结果

二、致病性及保守性分析

PolyPhen 2及Mutation Master软件均预测该突变位点为致病突变，预测分数均为1.00 （见图3）。UniProt软件分析示，p.Arg634在不同物种间高度保守（见图4）。

图3 PolyPhen 2软件预测突变位点的致病性

图4 RET基因634位氨基酸保守性分析

讨论

一、先证者与家系成员的诊断过程

本研究报道的MEN2A家系先证者以骨痛为首发症状，实验室检查显示血钙、PTH及降钙素水平升高，B超检查发现单侧肾结石，最终经手术病理证实存在单侧甲状旁腺腺瘤和MTC，结合RET基因突变检测结果，最终明确诊断为MEN2A。因先证者母亲及妹妹先后在外院被诊断为MTC，由此推断其母亲及妹妹发病的分子遗传学机制也可能为RET基因突变，故该家系为RET基因突变导致的MEN2A家系。

二、MEN2A患者的临床表现及诊断

MEN2A是多发性内分泌腺瘤的一种亚型，临床表现主要包括MTC、嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma，PCC）和原发性甲状旁腺功能亢进症（primary hyperparathyroidism，PHPT）[9]，少数患者可出现肩胛间区皮肤苔藓淀粉样变和（或）先天性巨结肠[11]。在MEN2A患者中，MTC的发生率＞90%[3]，早期患者常无特殊症状，往往是经触诊和（或）甲状腺影像学检查时意外发现，检测血清降钙素水平以及甲状腺超声和甲状腺结节细针穿刺细胞学检查可确诊[12]。PCC的发生率占MEN2A的40%～50%[3]，常为双侧、多发，患者临床表现为阵发性高血压、头痛、心悸以及多汗等，可通过检测血或24 h尿甲氧基肾上腺素及甲氧基去甲肾上腺素浓度进行定性诊断；CT或MRI检查对PCC也有较好的诊断灵敏度，可用于定位诊断[13]；功能影像学定位则首选碘-123-间位碘代苄胍核素显像，其诊断PCC的灵敏度为85%～88%[9,13-14]。若未发现肿瘤但定性诊断高度怀疑为PCC，则可进一步予行氟-18-二羟基苯丙氨酸正电子发射断层成像，其检出PCC的灵敏度可达81%～100%[15]。在MEN2A中，PHPT的发生率为10%～20%[9]，疾病隐匿，早期患者可出现口干、乏力、夜尿增多等症状，患者多因骨痛和（或）泌尿系结石症状而首诊，测定血清游离钙、PTH水平，并行甲状旁腺B超或锝-99m-甲氧基异丁基异腈单光子发射计算机体层显像以及全身核素骨显像等辅助检查，同时排除继发性和散发性甲状旁腺功能亢进后，方可诊断该病。

三、致病基因及发病机制

1993年，Donis-Keller等[16]首次报道了MEN2A是由RET原癌基因突变所致。RET原癌基因位于染色体10q11.2上，其编码的酪氨酸激酶受体包含3个功能结构域——胞外配体结合域、疏水跨膜结构域和细胞质结构域[17]。其中，胞外配体结合域包含一个富含半胱氨酸区域，而高度保守的半胱氨酸结构域对于二硫键的形成至关重要；其细胞质结构域含10个磷酸化位点，可与共受体GFRα1～GFRα4结合，促使胞内酪氨酸残基磷酸化，通过下游的信号转导，调控细胞的增殖和分化。突变体通过半胱氨酸间的二聚体化或者基因的剂量效应（突变型的扩增或野生型的缺失）增强了RET酪氨酸激酶信号转导的功能，激发细胞内酪氨酸激酶自动磷酸化，导致细胞过度增殖以及肿瘤生长[17]。迄今报道的导致MEN2A的基因突变均为RET原癌基因突变，且其中85%的突变位于第11外显子634位点[18]，与本研究一致。另有报道显示，少数突变位于第10外显子的611、618、620位点和第11外显子的631位点[2]。RET基因突变位点与MEN2A表型之间有着密切的联系，美国甲状腺协会[12]根据不同的RET突变位点将MTC风险分为中、高、极高3个等级。等级越高，意味着肿瘤侵袭能力越强，甲状腺手术需要切除的范围越大及预防性切除甲状腺的年龄越小。位于第11外显子的634密码子p.Cys634位点突变（p.Cys634Arg或p.Cys634Gly、p.Cys634Phe、p.Cys634Ser、p.Cys634Trp、p.Cys634Tyr）属于高风险，与携带其他突变位点的患者相比，携带该位点突变的患者除了发生MTC之外，同时伴有PCC、PHPT的可能性也最大。在MEN2A患者中，MTC表现出与年龄相关的外显率[19-20]，据报道，最小的患者只有5岁[18]。因此，美国甲状腺协会建议，该突变位点携带者尽可能在5岁之前进行预防性全甲状腺切除术（包括或不包括中央淋巴结切除术），并尽快开始PCC和PHPT的筛查[12]。国内最常见的RET基因突变位点也是第11外显子的634、611、620、768位点[21-22]。根据美国甲状腺协学风险分级，611、620、768位点突变提示MTC侵袭力为中度风险，同时在MTC的基础上发生PCC和PHPT的可能性较小，尤其是768位点突变。本研究报道的该家系先证者为高风险（p.Cys634Tyr），就诊时甲状腺及甲状旁腺已经累及，术后病理检查结果证实MTC已发生局部淋巴结转移。因先证者在甲状腺手术之后进行基因诊断，因此对于其残存的右侧甲状腺进行了密切随访，包括血清降钙素和癌胚抗原水平检测以及颈部B超检查等。尽管先证者术后短期随访显示，上述指标在正常范围之内（见表1），但结合其基因诊断，仍建议其进行预防性右侧甲状腺切除及右侧中央区颈淋巴结清扫手术，先证者表示愿配合密切随访，但暂时拒绝再次手术。

四、随访及预后

MEN2A患者的预后主要由其MTC病情程度决定，相较PCC及PHPT，MTC具有进展快、易侵袭、术后易复发的特点。研究表明，MEN2A患者中，MTC伴有淋巴结转移者的术后复发率高达50%[23]，并且复发风险可持续至术后20年左右[24]。因此美国甲状腺协学指南推荐，MEN2A患者行MTC切除术后应进行长期随访，需每6个月监测血癌胚抗原和降钙素的水平。颈部体格检查发现肿块以及血生化检测降钙素升高的患者，需行颈部CT检查以了解MTC复发情况[12]。MEN2A患者中，相较于MTC而言，PHPT恶性度低，手术可治愈，且术后复发率较低，约为4%[25]，患者的预后良好。但MEN2A患者可能同时存在2个或2个以上的甲状旁腺腺体的增生，因此PHPT术后也应重视监测血钙和PTH以及早发现新发甲状旁腺腺瘤或增生。MEN2A患者预后的关键是干预术后复发的侵袭性MTC，这也是近年来该病在国际上的研究热点[26]。Elisei等[27]开展的一项前瞻性、随机、安慰剂对照Ⅲ期临床试验表明，RET受体酪氨酸激酶抑制剂（卡博替尼）相对安慰剂能够显著延长侵袭性MTC成年患者的无进展生存期（11.2个月比4.0个月）。Chuk等[28]开展的一项Ⅰ期临床试验表明，卡博替尼能显著降低侵袭性MTC儿童及青少年患者的降钙素水平至基线的24%～87%。同时，对于携带RET基因突变且有生育要求的MEN2A患者，美国甲状腺协会指南[12]建议进行体外受精，将排除RET基因突变的受精卵移植入宫内，通过遗传干预，切实阻断突变的RET基因在下一代传递。国内黄荷凤院士研究团队对携带RET基因突变的亲代体外受精的受精卵进行RET基因单倍型筛选，对MEN2A患者的子代成功进行遗传干预[29]。

总之，结合本研究报道的先证者及其家系成员的临床特点及基因测序结果，先证者为RET基因突变导致的MEN2A诊断明确。结果提示临床医师应对MEN2A先证者及家系内成员进行积极的突变基因筛查，从而采取合理、全面的临床干预措施，改善患者的预后及指导其生育。