骨桥蛋白在成釉细胞瘤中的表达及意义

赵严礼 张铁成 唐瞾隆 陈辉 周永强 刘桂才

成釉细胞瘤是口腔颌面部常见的牙源性良性肿瘤之一[1]，约占上下颌骨良性肿瘤的10%，其虽生长缓慢，但具有局部侵袭性的特点。成釉细胞瘤的发病病因不明，多数学者认为其可能来源于各种牙源性上皮细胞，如牙源性滤泡上皮衬里等[2]。成釉细胞瘤的术后复发率较高，往往认为是与其具有局部侵袭性有关，临床上也可见恶变[3]。现阶段，对成釉细胞瘤的治疗多采用广泛手术切除病变骨质和(或)带血管蒂腓骨或髂骨移植修复颌骨缺损的方法治疗该疾病，术后往往对患者的生活质量有一定的影响。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是细胞基质蛋白小整合素结合配体N端连结糖蛋白(small integrin-binding N-linked glycoprotein，SIBLING)家族中的一员[4]，在正常组织中OPN表达水平很低，但在一些肿瘤组织中表达水平较高[5]。本文通过对研究骨桥蛋白在临床上较常见的成釉细胞瘤中的表达情况，初步探讨其与成釉细胞瘤生物学行为的相关性，旨在为临床上治疗成釉细胞瘤提供新的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 实验组60 例(滤泡型32 例，丛状型20 例,单囊型8 例)成釉细胞瘤标本取于南通市口腔医院口腔颌面外科。标本中男31 例,女29 例,年龄12～57 岁,平均30.32 岁。对照组取10 例门诊阻生牙拔除时所切除的正常健康牙龈黏膜组织。

1.1.2 主要试剂 透明质酸酶、Anti-Mouse IgG Antibody、Bovine serum albumin(BSA)、DAB substrate(武汉博士德生物有限公司)；Anti-OPN Antibody(美国Baylor大学Dr.Qin实验室)。

1.1.3 主要仪器 病理石蜡切片机(徕卡公司，德国)；电热恒温培养箱(Beckman公司，美国)；高级荧光显微镜(Eclipse 90i，日本尼康)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常规制片，恒温加热箱中70 ℃烘烤切片4 h；二甲苯脱蜡；梯度乙醇水化；苏木素染色；盐酸酒精分化；0.5 %伊红染色；梯度无水乙醇脱水；透明；封片；置于室温凝固，备用观察。

1.2.2 免疫组织化学SP法 70 ℃烤片24 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水， 3%过氧化氢处理10 min，修复液37 ℃，孵育60 min，山羊混合血清封闭4 ℃过夜，次日加入稀释(1∶400)Anti-Osteopontin鼠抗一抗， 4 ℃过夜，次日加入即用型山羊多克隆抗体二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，透明，封片，拍片。

1.2.3 结果判定 胞浆中出现黄色颗粒为阳性着色。评分判断标准[6]A(按切片中细胞显色有无及深浅评分)： 0 分为细胞无色； 1 分为浅黄色； 2 分为棕黄色； 3 分为棕褐色。 B(按切片中显色瘤细胞占切片中瘤细胞的比例评分)： 1 分为25%以下； 2 分为25%～75%； 3 分为75%以上。 每例积分=A×B，按积分高低分为:阴性(-)，积分0 分；弱阳性(+)， 积分1～3 分；中度阳性(++)，积分4～7 分；强阳性(+++)，积分>7。

1.3 数据处理和统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件，采用χ2检验分析成釉细胞瘤2 种主要组织学类型与正常牙龈黏膜中骨桥蛋白表达阳性率的差别，P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE 染色

染色结果见图 1。

2.2 免疫组织化学染色

结果如图 2，骨桥蛋白在正常的牙龈黏膜呈现阴性表达，在滤泡型成釉细胞瘤上皮细胞的细胞核、星网状层细胞和瘤周基质呈阳性表达；在丛状型成釉细胞瘤中的肿瘤上皮内和在肿瘤间的结缔组织呈现阳性反应，在单囊型成釉细胞瘤中瘤体细胞的细胞核和瘤周基质呈现阳性反应。

图 1 确定成釉细胞瘤的组织分型(HE， ×100)

图 2 各组样本中OPN的表达(SP, ×200)

滤泡型成釉细胞瘤表达阳性率为24/32(75%)，丛状型成釉细胞瘤表达阳性率为16/20(80%)，单囊型成釉细胞瘤阳性率5/8(62.5%)。滤泡型成釉细胞瘤和丛状型成釉细胞瘤及单囊型成釉细胞瘤的OPN的阳性表达均高于正常牙龈黏膜，差别具有统计学意义(P<0.05)(表 1)。

表 1 OPN在各组样本中表达的比较

3 讨 论

OPN富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，是首次发现在骨组织中的骨唾液涎蛋白，随后的研究发现，在肾、脑、巨噬细胞、血管平滑肌细胞和许多细胞上皮衬里也有表达[7]。OPN的结构中含有丰富的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸，它是一种酸性的分泌型磷酸化糖蛋白，有多种功能[8-9]，如促进细胞黏附、生存、转移和调节细胞免疫。研究表明[10-11]，在骨的重建、创伤及炎症的修复、肿瘤的转移和自身免疫疾病中也可检测到OPN的高表达。另外，OPN还可通过激活信号通路来促进肿瘤形成和干扰肿瘤的预后，甚至可导致肿瘤的恶变[12]。成釉细胞瘤虽是一种颌骨良性肿瘤，但其生物学行为具有局部侵袭性，术后复发率比较高。最近的研究证实[13]，OPN在致癌和癌症的转移中起着重要的作用。此外，高表达的OPN与各种肿瘤[13-15]，如肝癌、宫颈癌、胰腺癌和前列腺癌的恶变、转移及预后不良有关。现阶段，对成釉细胞瘤中OPN表达的研究较少，本文通过检测OPN在成釉细胞瘤中的表达情况，探讨其在该类肿瘤发生及复发中的可能意义。

本研究结果显示，在丛状型，滤泡型及单囊型成釉细胞瘤中，OPN的阳性反应主要表达在类成釉细胞和类星网状层细胞的细胞核，瘤周反应主要集中于肿瘤基质，在成釉细胞瘤体上皮细胞的细胞核、星网状层细胞和瘤周基质中OPN的阳性表达率45/60(75%)。而在正常的牙龈上皮细胞中，OPN的表达为阴性或弱阳性，阳性表达率为1/10(10%)。Wang等[16]认为OPN可能由星网状细胞分泌和合成，通过成釉细胞样细胞加工修饰分泌到成釉细胞瘤周基质中参与瘤体发生发展，也不排除成釉细胞瘤样细胞分泌少量的OPN。图 2中OPN的阳性表达，提示在成釉细胞瘤不同区域OPN的表达也不同，细胞核阳性表达较高，该阳性表达可能提示OPN在该区域活性可能较高。表 1可见，正常牙龈黏膜中OPN的阳性表达均小于滤泡型成釉细胞瘤，丛状型及单囊型成釉细胞瘤中OPN的阳性表达，且具有统计学意义(P<0.05)。

OPN可以增强肿瘤细胞的转移、侵袭和转移，激活破骨细胞，并且可以保护肿瘤细胞抵御免疫介导的细胞毒性反应，成釉细胞瘤瘤体细胞和瘤周结缔组织中的高表达的OPN至少可以部分的解释为什么实性的成釉细胞瘤有局部侵袭行为和较高的溶骨能力[17]。研究表明[18]，在牙源性角化囊肿中的上皮衬里和结缔组织中也检测到OPN的高表达，因此我们可以猜测成釉细胞瘤中OPN的高表达有可能与该肿瘤高复发率有关。

现阶段对于成釉细胞瘤的治疗，手术仍是首选，创伤较大，易于复发，多次复发手术严重影响面容，并造成功能障碍。对患者的生活质量有一定的影响。本实验结果提示OPN很可能参与成釉细胞瘤的发生发展过程,可通过研究成釉细胞瘤的生物学行为和OPN表达之间的关系，将OPN作为成釉细胞瘤的诊断和评价预后的有效指标。鉴于此，将OPN作为靶基因来治疗成釉细胞瘤是有可能的。但OPN能否作为一个有价值的靶向治疗, 在成釉细胞治疗方面是否起到积极作用，仍需进一步的研究。