3D打印Ti-6Al-4V多孔支架碱酸热处理并负载黄芩苷涂层的制备及生物学评价

李伶俐 王之发 李潇

提高种植体的骨结合效率一直是研究的热点。现有的研究发现可以通过改变种植体形态结构，表面活化处理等方式来增加其骨传导性和诱导性[1]。目前种植体材料中使用最广泛的是具有良好机械性能的钛及钛合金。运用3D打印技术可让材料兼具理想外形和精密内部结构，降低应力屏蔽带来的不良影响。碱酸热(alkali-acid-heat,AlAcH)处理是一种简单的化学改性方法，可在复杂的多孔结构表面建立均一疏松的微纳米级形貌，同时保持足够的力学性能[2]。

黄芩苷(baicalin,BC)是从黄芩的干燥根中提取的主要活性成分，分子式是C21H18O11。研究发现BC具有多种不同的药理活性，如抗菌、抗炎和影响骨代谢过程等[3]。然而，国内外尚未见有关BC用于钛基金属涂层的报道。本实验通过研究3D打印Ti-6Al-4V多孔支架碱酸热处理后负载BC涂层的机械性能和对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物学影响，为种植体表面改性及应用BC涂层提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

实验材料：钛粉(AP&C,加拿大)；黄芩苷(纯度95%，上海麦克林)；CCK-8试剂盒(同仁，日本)；ALP试剂盒(南京建成)；BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪)；Calcein AM细胞活力检测试剂盒(Useverbright，美国)；总RNA提取试剂盒(Thermo Fisher，美国)。实验细胞：SD大鼠骨髓间充质干细胞(中国科学院细胞库)。主要仪器：SLM 3D打印机(EOS M280，德国)；高压釜(DHG-9140A)；电子万能材料试验机(INSTRON，美国)；Merlin高分辨场发射扫描电子显微镜(ZEISS，德国)；Acquity UPLC H-Class超高效液相质谱联用仪(Waters，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；StepOne qPCR仪(Applied Biosystems，美国)。

1.2 设计并3D打印多孔支架，检测其弹性模量

用Solidworks软件绘制300 μm杆径，600 μm孔径的同金刚石晶体结构的多孔支架，规格为Φ10 mm×1.5 mm(压缩试验Φ10 mm×15 mm)，传输打印。取5 个成品上万能试验机检测其弹性模量。

1.3 制备实验样品

将样品分别用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗15 min，干燥备用。将样品分为4 组，空白对照组(B)，碱酸热组(A)样品处理参照相关文献[4](华工)，负载组分为空白负载组(B-BC)和碱酸热负载组(A-BC)。将BC粉末溶于含DMSO<1%的F12/DMEM培养基(10%FBS)，配置成2 mg/ml BC溶液，每10 ml BC溶液中放置3 个支架，超声震荡30 min，清洗后室温干燥备用。

1.4 表面形貌特征及BC释放效率

每组各取3 个样品，通过扫描电镜观察表面形貌。将各组样品浸泡于24孔板中，每组3 片，加入1 ml PBS缓冲液，分别于2、8、24、72 h取出PBS溶液，用超高效液相色谱仪检测BC的释放浓度。

1.5 细胞培养

将SD大鼠BMSCs复苏后传代培养，采用F12/DMEM培养基(10%FBS)，待细胞生长密度达80%，用胰酶消化后传代1 次，待细胞稳定后用于后续实验。

1.6 BMSCs增殖情况

将样品放入48孔板中，每孔一个样品，取生长状态良好的BMSCs制备成细胞悬液，以1×104/孔的密度接种于48 孔板中,共培养2、4、7 d后取出样品按Calcein AM产品说明书检测。

1.7 ALP活性检测

将样品放于24孔板中，每孔一个样品，取BMSCs细胞悬液，以2×105/孔的密度接种于24孔板中，共培养7、14 d后取出样品，去离子漂洗2 遍后放于新24孔板，每孔加入Western及IP细胞裂解液60 μl，裂解30 min，吹打收集裂解液后12 000×g高速低温离心20 min，收集上清液按说明书检测。

1.8 RT-qPCR

细胞培养7、14 d后，按说明书提取总RNA，按试剂盒进行逆转录获得cDNA，β-ACTIN作为内参基因。实时定量荧光PCR：10 μl反应体系，实验操作按说明书进行，实时定量PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，40循环。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 3D打印设计成品并检测弹性模量

为保证多孔支架的机械强度，本实验采用金刚石晶体结构设计，打印获得孔孔相通的网格支架(图 1)。压缩试验测得样品弹性模量为(644.00±38.47) MPa，符合人体骨的弹性模量(0.2～2) GPa[2]。

2.2 表面形貌分析

扫描电镜观察各组样品表面结构(图 2)，可见大量未完全融化的微球。B组支架结构连续，没有明显裂痕。A组可见表面微球数量有所减少，与B组相比表面粗糙，可见表面结构明显改变，形成微纳米级的疏松草丛状结构。负载组均可见支架表面有壳层结构，壳层在支架微球边缘会出现裂隙，高倍镜下可见A-BC组壳层表面也有明显浅凹结构而B-BC组壳层表面依然连续平整，这与涂层底部结构相对应。

2.3 BC涂层释放效率

经过相同浓度BC溶液处理的各组样品显示出不同的负载能力(图 3)。A-BC组负载量多于B-BC组，平行组间浓度差更小，负载能力更加稳定，且缓释速率最快。缓释3 d后2 组释放量接近，但A-BC组的BC浓度始终比A-BC组高。这表明碱酸热处理后的Ti-6Al-4V多孔支架更有利于BC涂层的负载。

图 1 3D打印成品设计图

图 2 不同放大倍数下的各组样本表面SEM形貌

图 3 B-BC组和A-BC组黄芩苷涂层释放曲线

2.4 BMSCs增殖情况

A值提示BMSCs在各组支架上生长2、4、7 d时均能持续增殖(图 4)。A-BC组和B-BC组在第2、4天时细胞增殖速度较B组慢(P<0.05)。在第7天时，A-BC组细胞增殖速度明显高于A组和B-BC组(P<0.05)，但与B组无统计学差异(P>0.05)。

2.5 BMSCs中ALP活性检测

在7 d时，A组、A-BC组、B-BC组细胞内ALP活性均高于B组(P<0.05)。在14 d时各组之间没有统计学差异(P>0.05)(图 5)。

2.6 RT-qPCR结果

BMSCs培养7 d后，实验组中BSP和OCN的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)，其中A-BC组BSP的mRNA水平明显高于其他组，B-BC组OCN的mRNA水平明显高于其他组(P<0.05)。细胞培养14 d后，各实验组BSP 的mRNA水平均高于对照组(P<0.05)，A-BC组BSP的 mRNA水平高于B-BC组(P<0.05)，B-BC组和A-BC组的OCN的mRNA水平高于其他组(P<0.05)(图 6)。

图 4 各组多孔支架表面对BMSCs增殖的影响 图 5 第7、14天各组BMSCs ALP活性

for 2, 4 and 7days 7 and 14 days

图 6 培养第7、14天各组多孔支架表面BMSCs的OCN、BSP基因表达情况

3 讨 论

传统的钛基种植体弹性模量远大于人正常骨，在种植体承重时会与骨组织发生相对位移，发生“应力屏蔽”从而影响骨结合过程[5]。目前对于种植体形态的研究都侧重于模拟骨小梁的几何和力学特性。有研究发现孔径为200～1 000 μm的支架在保证强度情况下还能为组织生长提供更多空间[2]。3D打印技术可控制材料的孔隙大小和孔隙率，从而降低材料的弹性模量。孔隙相通的3维结构利于细胞迁移、血管化、氧气运输和营养物质代谢[1]。本实验中结合结构设计和3D打印工艺，可以获得与人体骨相似弹性模量的钛合金多孔支架。为了提高钛基种植体的骨结合程度，目前常用的方法有种植体表面改性及涂层技术[6]。将钛合金进行碱酸热处理即可在表面形成具有微纳米级粗糙度的带正电荷的氧化钛层，并具有一定骨诱导性[7]。从本实验扫描电镜结果看出碱酸热处理后材料表面形成了微纳米级的丛状结构，这与之前的研究结果一致[4]。

BC的分子结构式中带有多个酚羟基，酚羟基是具有弱酸性带负电荷的，不仅可以与金属离子结合还可以与蛋白分子上的正电荷结合[8]。本实验中BC涂层通过物理沉积负载于金属表面，从释放曲线可以看出A-BC组负载涂层浓度更高，负载浓度更一致，并且负载效率更高。可能的原因是在负载涂层过程中带负电荷的BC溶液可以与带正电荷的碱酸热处理金属表面通过静电作用和物理吸附相结合。另外BC还具有高效低毒和诱导成骨的特性[9]，从本实验中CCK-8检测A值可见BMSCs在各组材料上随着时间的延长都发生增殖。在培养2、4 d时，实验组A值小于对照组(P<0.05)，说明实验组对BMSCs的增殖没有促进作用，可能的原因是细胞增殖与分化存在相反关系[10]。但在7 d时，A-BC组A值明显高于其他实验组(P<0.05)，提示在后期碱酸热处理负载BC涂层与其他表面处理相比能加快BMSCs增殖速度。ALP被认为是成骨细胞分化的早期标志之一，参与骨形成、代谢和再生等过程[11]。从ALP的结果中可以看出7 d时BC涂层组表面BMSCs内的ALP活性高于对照组(P<0.05)。但是14 d时BMSCs的ALP活性较7 d时低，可能的原因是BMSCs细胞从分化期向下一矿化期转变，这一结果与之前的研究结果一致[12]。在BMSCs分化的不同阶段，细胞会表达相应的基因。OCN和BSP是与细胞分化成熟密切相关的蛋白，OCN活跃于间充质干细胞分化晚期[13]。BSP不仅与细胞成骨分化有关，还影响到骨基质的矿化。在本实验中发现B-BC组与A-BC组在第7和14天时，BSP和OCN的基因表达水平均高于对照组(P<0.05)，A-BC组的BSP的基因表达水平高于B-BC组(P<0.05)，这提示BC涂层有利于提高BMSCs的成骨分化能力，碱酸热处理结合BC涂层可促进骨基质的矿化。该结果与之前研究结果一致[14]。可能的原因是BC通过调控Wnt/β-catenin信号而促进BMSCs的分化成熟[15]。

本实验结果表明通过3D打印技术可以获得与人体骨弹性模量相似的钛合金多孔支架，经过碱酸热处理和负载BC涂层后仍具有良好的生物相容性，可以促进BMSCs的成骨向分化。未来的研究可以深入探讨不同浓度BC涂层对BMSCs增殖分化的影响以及体内实验中该多孔支架的成骨情况。为今后种植体表面修饰中药涂层方面提供了一个新的选择。