尼可地尔对急性心肌梗死大鼠心脏功能和冠脉微循环相关因子的影响*

张大武 刘剑刚 晁田田 熊 双 董国菊

心血管疾病是国人死亡首要病因，随着急诊介入的快速发展和冠心病二级预防药物的普及，急性心肌梗死(AMI)的死亡率得到了极大地控制[1]。但是，仍有部分患者，尤其农村AMI患者早期经皮冠状动脉介入时机滞后，导致梗死后不可逆的心肌损害和心功能受损，严重影响患者预后。如何挽救梗死后损伤心肌一直是心血管病研究的焦点。

尼可地尔是一种ATP敏感钾离子(KATP)通道开放剂，也能作为一氧化氮供体扩张血管。其化学结构由烟酰胺衍生物与硝基构成，既作用于动脉血管床，又作用于静脉血管床[2]，能显著改善冠状动脉痉挛，且疗效优于硝酸酯类药物[3]，还能降低冠心病患者全因死亡和心脏性猝死[4]。本文应用尼可地尔干预AMI模型大鼠，观察其心肌损伤标记物、心肌梗死面积、心脏形态和功能，以及冠脉微循环影响因子内皮素(ET)、降钙素基因相关肽(CGRP)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)和血栓烷B2(TXB2)等指标变化，为临床研究尼可地尔干预AMI提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar大鼠40只，SPF级，体质量200g-230g，雄性，动物质量合格证号：11400700262477，许可证号:SCXK(京)2016-0006，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，适应性饲养1周，自由摄食与饮水。

1.2 主要药物和试剂

尼可地尔片(5mg/片)，由西安汉丰药业有限公司生产(国药准字H61022860)，根据体表面积法，大鼠给药剂量g/(kg·d)=成人每日剂量(g)×大鼠体重与体表面积比值/人体重与体表面积比值。按照尼可地尔片临床给药剂量换算后给予大鼠2.7mg/kg体质量灌胃。

心肌肌钙蛋白T(cTnT)检测ELISA试剂盒(批号：20191208)、ET检测ELISA试剂盒(批号：20191210)、CGRP检测ELISA试剂盒(批号：20191210)由北京北方生物技术研究所有限公司提供；TXB2检测ELISA试剂盒(批号：20191210)，6-Keto-PGF1αELISA试剂盒(批号：20191210)由北京华英生物技术研究所提供；2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉末(TTC，美国Sigma-Aldrich公司生产，批号：T0765)，由北京莱博生物实验材料研究所提供，实验时将其用磷酸盐缓冲液配制成0.5%应用液。

1.3 仪器

DR-200BS型全自动酶标分析仪(中国无锡华卫德朗仪器有限公司)；7160型全自动生化仪(日本HITACHI公司)；CARDIPIA 800B型心电图仪(中国秦皇岛市康泰医学系统有限公司)；GE Vivid E95型超声多普勒检测仪(美国GE有限公司)；EPIQ5 S12-4型心脏超声高频探头(荷兰PHILIPS医疗设备有限公司)。

1.4 模型制作与分组处理

参照有关文献[5]，40只大鼠以2%戊巴比妥钠水溶液(0.2ml/100g体质量)腹腔麻醉后，置于解剖台上仰卧位固定，连接Ⅱ导联心电图。剪毛备皮胸骨左侧并消毒。沿胸骨左缘3-4肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉层，快速挤出心脏，剪开心包膜，在左心耳下缘、肺动脉圆锥的左缘之间，体表左冠状静脉投影位置(左冠状动脉前降支)上1/3处穿刺进针，其中30只结扎血管，观察心电图变化，以其出现R波振幅降低、ST段偏移、T波改变(弓背样抬高或T波高耸)，且肉眼观察心肌呈暗红色，即判断为心肌缺血和心肌梗死形成[6]；还原心脏，逐层缝合胸骨和肌肉层。之后存活24h为成模进入实验大鼠，共20只。余10只大鼠只穿线不结扎，作为假手术组。各组大鼠均肌肉注射青霉素钠20万U/天，连续3天，预防感染。实验后动物按照《北京市实验动物管理条例》和动物伦理学规定处置。

成模大鼠随机分为模型组和尼可地尔组，每组10只；假手术组10只。术后48h开始，尼可地尔组连续灌胃尼可地尔(2.7mg/kg体质量，灌胃浓度0.27mg/ml)28天，1次/天，模型组和假手术组灌胃等体积纯净水。末次给药40min后，各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠水溶液(0.2ml/100g体质量)麻醉后，平行检测以下各类指标和血液指标，观察心肌梗死面积。

1.5 指标检测

1.5.1心脏超声指标：三组大鼠麻醉后，采用超声多普勒仪在同一心动周期下测量心脏形态学指标，包括左心室收缩末期内径(LVEDS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、室间隔舒张末期厚度(IVST)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWT)、心脏左室射血分数(LVEF)。连续测量3个心动周期，取平均值作为每只大鼠测定值，超声检查分析由不知道大鼠分组情况的两名专科医生完成。

1.5.2血清标志物cTnT及微循环因子指标：完成超声检查后，各组大鼠经腹主动脉采血4ml，静置后离心，吸取血清，采用ELISA分别检测cTnT、ET、CGRP、TXB2和6-Keto-PGF1α水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书。

1.5.3心肌梗死面积比：三组大鼠取血后，参照文献[7]，用注射器吸取TTC溶液2-4ml自下腔静脉注入心脏，3min后摘取心脏，置入-20℃冰箱中速冻30min后，从心尖部至心底部依次垂直于长轴均匀横切成5张同样厚度的心肌组织切片，于10%中性甲醛溶液中固定30min。在统一光照条件下使用Canon IXUS 990 IS相机微距拍照，应用图像分析软件Image Pro-Plus Version 6.0(美国Media Cybernetics公司)计算心肌梗死面积比，即心肌梗死面积与心脏面积之比。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心脏形态和功能指标比较

假手术组大鼠心脏超声心动图可见左室心肌厚度均匀，舒缩运动正常。模型组超声心动图则显示梗死区域心室壁变薄，部分心室壁局部向外扩张，呈室壁瘤样改变，并随心室舒缩活动呈明显反常运动。三组大鼠LVEDD、LVEDS、IVST、LVEF水平差异均有统计学意义(P<0.01)，而LVPWT水平无统计学差异(P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD和LVEDS显著升高(t=4.48，4.80，均P<0.01)，IVST和LVEF显著降低(t=4.65，5.47，均P<0.01)。与模型组比较，尼可地尔组LVEDD和LVEDS明显降低(t=2.42，2.08，均P<0.05)，LVEF显著升高(t=3.17，P<0.01)，而IVST水平无统计学差异(P>0.05)。结果见图1，表1。

图1 各组大鼠心脏形态和功能超声

表1 各组大鼠心脏形态和功能指标比较均=10)

2.2 各组大鼠cTnT和微循环因子水平比较

三组大鼠cTnT、ET、TXB2水平差异均有统计学意义(P<0.01)，而CGRP、6-Keto-PGF1α水平无统计学差异(P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠血清cTnT、ET和TXB2水平显著升高(t=4.16，2.50，3.04，P<0.05或P<0.01)，与模型组比较，尼可地尔组大鼠血清cTnT、ET和TXB2水平明显降低(t=2.71，2.10，2.29，均P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠微循环因子水平比较均=10)

2.3 各组大鼠心肌梗死面积比比较

三组大鼠心肌梗死面积比差异有统计学意义(F值为287.39，P<0.01)。与假手术组比较，模型组心肌梗死面积比明显升高(0.00±0.00 vs 0.34±0.03，t=2.27，P<0.01)。与模型组比较，尼可地尔组心肌梗死面积比明显降低(0.34±0.03 vs 0.27±0.03，t=4.80，P<0.01)。

图2 三组大鼠心肌梗死面积比较(TTC染色，标尺1格=1mm)

3 讨 论

心肌梗死后心脏功能受损是多种因素如缺血再灌注损伤、微循环障碍、炎症反应以及神经内分泌激素激活等多种因素作用的结果[8]。其中微循环障碍对增加AMI患者心血管事件的发生有重要影响[9]。近年来研究显示尼可地尔能通过扩张微小动脉，改善冠状动脉血流和心肌收缩功能，从而改善AMI患者预后[10]。本实验通过制作AMI大鼠模型及采用尼可地尔灌胃干预措施，观察心肌梗死后大鼠心功能、心肌损伤标记物和冠脉微循环影响因子水平以及心肌梗死面积的变化，结果显示，尼可地尔能明显改善心功能、降低心肌损伤标志物和微循环因子水平，缩小心肌梗死面积。

冠脉微循环是由心脏微动脉、毛细血管和微静脉组成的心肌网络结构，能有效调节心肌血流和代谢。其功能障碍受到血管内皮功能紊乱、血小板活化、神经激素水平失衡及炎症反应等的影响[11]。ET和CGRP作为血管内皮细胞舒缩的两个最重要氨基酸多态，分别是迄今为止发现的最强缩血管物质和最强扩血管物质，其水平升高可收缩或扩张冠脉微血管。在本实验中，AMI模型大鼠ET水平显著增加，给予尼可地尔后明显降低，但CGRP含量未见明显增加，这与Sekiguchi等的报道结果相符[12]。表明尼可地尔可能主要通过调节ET水平发挥改善微循环障碍的作用。

而TXB2和6-Keto-PGF1α是一对反映血小板活化的指标，分别为血栓烷A2(TXA2)和前列环素2(PGI2)的稳定代谢产物，两者水平变化可提示血小板聚集、血管痉挛收缩或血栓形成。本研究结果显示，AMI大鼠血清TXB2含量显著增加，给予尼可地尔后显著降低，6-Keto-PGF1α水平则无明显变化。表明尼可地尔可能主要是通过抑制TXA2生成，从而发挥抑制血小板活化和改善微循环的作用。

心脏超声指标常用于评判心脏形态和功能变化，不论对缺血性心脏病AMI抑或心力衰竭，也无论对AMI后心脏功能保护和预后的评价。有研究认为，LVEDD和LVEF更具价值[13-15]。本实验结果显示，AMI模型大鼠心肌LVEDD显著增大，LVEF显著降低；给予尼可地尔灌胃干预，其LVEDD减小，LVEF显著提高。表明尼可地尔可改善AMI大鼠心肌重塑和心功能。

综上所述，尼可地尔灌胃干预对AMI模型大鼠心脏形态和功能、心肌损伤标志物、冠脉微循环相关因子和心肌梗死具有明显的改善作用，为尼可地尔临床干预AMI应用研究提供了部分实验依据。