糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、CTRP3的表达及相关性初探*

徐园园 任亚丽 卢学超 解其华 王春华 魏迎凤，#

糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，是造成慢性肾功能衰竭的常见原因。研究发现肾小球系膜细胞功能紊乱参与糖尿病肾病的发病过程。转化生长因子β1(TGF-β1)是重要的致纤维化因子，参与调控细胞生长和肾小球系膜细胞增生以及细胞外基质的形成[1]，是诱导糖尿病肾病发生和发展的关键因子。补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP)家族是脂联素家族的一个分支，可调节胰岛素敏感性、炎症和脂质代谢。CTRP3(也称为Cartducin/COR26)是CTRP家族的重要成员，有研究发现 CTRP3与糖脂代谢有关，能增加胰岛素敏感性[2]。本研究旨在分析TGF-β1、CTRP3在糖尿病肾病大鼠肾组织中表达的变化并初步探讨CTRP3在其中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠16只，清洁级，体重260±20g，由南通大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证：SCXK(苏)2014-0001，使用许可证：SYXK(苏)2012-0031。所有动物适应性喂养1周后进行实验。

1.2 实验试剂及仪器

试剂：链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司(批号：S0130)，兔抗大鼠TGF-β1 多克隆抗体购自美国Abcam公司(批号：GR262076-9)、兔抗大鼠CTRP3多克隆抗体购自美国Abcam公司(批号：ab36870)，即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(批号：AR0010)，葡萄糖测定、尿素测定试剂购自上海科华生物工程股份有限公司(批号：20200122、202010212)，尿蛋白、甘油三酯、总胆固醇检测试剂盒购自美康生物科技股份有限公司(批号：191213102、200613101、200510201)，肌酐检测试剂盒购自日立化成诊断系统株式会社(批号：504AJA)，C反应蛋白检测试剂盒购自贝克曼库尔特(美国)股份有限公司(批号：447280)。

仪器：LEICA组织包埋机(EG1150型)，LEICA石蜡切片机(RM2145型)，病理组织漂烘仪(PHY型)，光学显微镜(日本OLYMPUS BX51)，日本日立全自动生化仪(LABOSPECT 008AS)，美国贝克曼库尔特特定蛋白分析仪(IMMAGE 800)。

1.3 方法

1.3.1动物分组和模型的建立：实验期间所有大鼠饲养在清洁级屏障动物房内，室内温度控制在(23±2)℃，湿度控制在55%±5%，自由采食和饮水，室内照明采用12h∶12h明暗交替。大鼠适应性喂养1周后，按随机数字法将16只大鼠分为糖尿病肾病组(DN组)及正常对照组(NC组)，每组各8只。DN组禁食12h后腹腔一次性注射STZ(60mg/kg)，NC组注射同体积的枸橼酸钾缓冲液。72h后采鼠尾血，采用葡萄糖氧化酶法(强生稳豪型血糖仪)测定血糖，如血糖浓度≥16.7mmol/L，则糖尿病模型造模成功。造模成功大鼠再饲养两周后收集尿液，每日平均尿量较造模前至少增加50%，且24h尿蛋白排泄率>30mg的大鼠定为糖尿病肾病模型大鼠。本文DN组大鼠全部造模成功。

1.3.2标本收集：糖尿病肾病大鼠造模成功后，两组大鼠继续常规饲养8周，于8周末处死前一天收集24h尿液，第8周末每只大鼠称重后腹主动脉采血，解剖肾脏去除包膜，留取肾脏组织。

1.3.3尿液及血液样本检测：采用全自动生化分析仪，邻苯三酚红钼络法测定24h尿蛋白。采用全自动生化分析仪测定血糖、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇，采用特定蛋白分析仪测定C反应蛋白。根据血肌酐及体重计算肾小球滤过率。

1.3.4肾脏组织病理学观察：将肾组织置入4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片后常规HE染色，光镜下观察肾组织病理改变。

1.3.5肾组织TGF-β1与CTRP3免疫组化染色：肾脏石蜡切片(厚3μm)，常规脱蜡至水，抗原修复，PBS反复冲洗，加入配置好的一抗(稀释浓度1∶500)，4℃摇床过夜，PBS反复冲洗，加入二抗(稀释浓度1∶1 000)，DAB显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。采用兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体及兔抗大鼠CTRP3多克隆抗体试剂盒，严格按照说明书操作。细胞质中有棕黄色颗粒状表达为TGF-β1和CTRP3阳性细胞。于400倍光镜下观察阳性细胞的表达情况，每张切片随机选取10个区域，采用Mias-2000图像分析系统测定阳性物质的积分光密度。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组大鼠生化指标及24h尿蛋白定量比较

DN组大鼠血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇、C反应蛋白较NC组升高，肾小球滤过率较NC组降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组大鼠生化指标及24h尿蛋白定量比较

2.2 两组大鼠肾脏病理改变

NC组大鼠肾小球未见损伤，系膜细胞、基质正常，未见炎性细胞浸润；DN组大鼠肾小球体积增大，肾小球系膜细胞及基质增多，肾小球内可见散在炎性细胞浸润(箭头所示)。

2.3 各组肾组织TGF-β1、CTRP3蛋白表达比较

免疫组化染色提示NC组大鼠肾组织中有极少量的TGF-β1表达，CTRP3在肾小球、肾小管中均有表达；DC组TGF-β1在肾小球、肾小管及肾间质内有表达(箭头所示)，CTRP3表达减少。见图2、图3。半定量分析结果显示，与NC组比较，DN组TGF-β1表达增加(P<0.01)，CTRP3的表达降低(P<0.01)。见表2。

表2 两组大鼠肾组织中TGF-β1和CTRP3蛋白表达水平比较

2.4 大鼠肾脏组织CTRP3蛋白水平与其它指标的相关性分析

Pearson相关分析结果提示：CTRP3蛋白水平与TGF-β1蛋白(r=-0.630)、血糖(r=-0.558)、24h尿蛋白(r=-0.665)、血肌酐(r=-0.638)、C反应蛋白(r=-0.531)呈负相关(P<0.05)，与肾小球滤过率呈正相关(r=0.577，P<0.05)，与尿素氮、甘油三酯及总胆固醇无明显相关性(P>0.05)。

3 讨 论

糖尿病肾病是一种由遗传和环境因素介导的复杂疾病，是终末期肾功能衰竭的主要病因，许多细胞和分子机制与糖尿病肾损害有关。糖尿病早期即引起基底膜增厚，足细胞凋亡和功能异常，肾小球内皮细胞损伤，导致肾小球屏障功能丧失。同时糖尿病也会引起肾小球系膜功能障碍、毛细血管阻塞和结节性病变，导致肾小球硬化[3]。本研究结果提示DN组大鼠血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇、C反应蛋白较NC组显著升高，肾小球滤过率较NC组显著降低，说明DN组大鼠存在糖脂代谢紊乱、炎症反应及滤过功能的损伤。DN组大鼠病理提示肾小球体积增大，肾小球系膜细胞及基质增多，肾小球内可见散在炎性细胞浸润，病理结果与血液和尿液提示结果一致。

CTRP家族是脂联素家族的一个分支，这个家族参与了各种疾病，包括动脉粥样硬化、肝病、胰岛素抵抗以及肾脏疾病等[4-6]。CTRP3是这一家族的重要成员，CTRP3的功能研究涉及到心血管系统、骨关节系统等多系统多方面[7]。近期研究发现，CTRP3可能在糖尿病及其并发症的病理生理过程中起重要作用。本研究结果显示DN组大鼠肾组织CTRP3蛋白表达水平降低，且大鼠肾组织中CTRP3蛋白表达水平与血糖呈负相关，提示CTRP3可能参与了糖尿病的血糖调节。一项关于小鼠的研究[8]结果提示，CTRP3基因水平降低与胰岛素信号传导受损和胰岛素敏感性降低相关。CTRP3基因水平的降低与胰岛素抵抗、肿瘤坏死因子-α和糖化血红蛋白相关，且随着CTRP3基因水平的降低，糖尿病患病风险增加[9]。故CTRP3可能是通过调节胰岛素信号传导和胰岛素敏感性途径来影响血糖水平。本研究结果亦提示大鼠肾组织CTRP3蛋白表达水平与C反应蛋白呈负相关，提示CTRP3可能与炎症反应有关。Ma等[10]研究结果提示，CTRP3通过改善炎症反应和激活腺苷单磷酸激活蛋白激酶(Adenine Monophosphate Activated Protein Kinase，AMPK)通路，改善胰岛素信号传导，发挥防治糖尿病心肌病的作用。但CTRP3改善炎症反应的具体机制尚不明确。本研究中大鼠肾组织中CTRP3蛋白表达水平与24h尿蛋白、血肌酐呈负相关，与肾小球滤过率呈正相关，提示CTRP3可能参与肾小球滤过功能的调节。Hu等[11]研究发现CTRP3的过度表达抑制了肾小球系膜细胞的增殖，减少了活性氧的产生，减少了细胞外基质的扩张，通过失活JAK2/STAT3信号途径预防糖尿病肾病。以上研究结果均提示CTRP3是糖尿病肾病的保护因素。

本文结果还显示DN组大鼠肾组织中TGF-β1 表达增加，支持TGF-β1参与了糖尿病肾病的纤维化过程。TGF-β包括一大类细胞因子，具有调节多种细胞类型的生长、分化和形态发生。TGF-β在肾小球硬化、系膜增生性肾小球肾炎等肾脏疾病中起着重要作用[12]。它刺激系膜细胞增殖和细胞外基质成分的产生，诱导肾组织上皮间质转化，在肾损伤的发病机制中起重要作用[13]。糖尿病患者的高血糖状态可诱导TGF-β1基因表达和肾小球系膜外基质的合成，导致肾小球硬化[14]。TGF-β1的增加可诱导内皮细胞间质转化，抑制肾小球内皮功能，使肾小球内皮细胞和足细胞之间的相互作用消失，足细胞损伤，出现蛋白尿[15]。因此，TGF-β1是糖尿病肾病发病的重要分子。DN组大鼠肾组织中CTRP3蛋白表达减少，相关分析提示大鼠肾组织CTRP3蛋白表达与血糖、24h尿蛋白、血肌酐、C反应蛋白呈负相关，与肾小球滤过率呈正相关。提示CTRP3与糖尿病肾病有关，可能参与了糖尿病肾病的代谢紊乱及炎症反应，是糖尿病肾病的保护因素，但具体机制尚不明确。相关分析亦提示CTRP3与TGF-β1存在负相关，究其原因可能因为TGF-β1可刺激肾小球系膜细胞增殖，而CTRP3的过度表达抑制了肾小球系膜细胞的增殖。但CTRP3改善肾小球系膜细胞的增殖作用是否是通过抑制TGF-β1通路来实现的还有待进一步研究。

综上所述，肾小球系膜细胞功能紊乱是糖尿病肾病的重要病理改变。许多细胞因子参与了糖尿病肾病的发生和发展。TGF-β1是重要的致纤维化因子，CTRP3可能成为糖尿病肾病治疗方案中一个新的靶点。但本试验为动物试验，样本量小，观察时间短，仅有免疫组化结果，存在一定的不足，故相关结论仍有待进一步研究证实。