胃癌组织中Cx43与p70S6K的表达及其临床意义

刘莎莎， 刘 欢， 赵 杨， 申兴斌

(承德医学院附属医院病理科， 河北 承德 067000)

胃癌(gastric carcinoma)是一种起源于人体胃粘膜上皮的恶性肿瘤。目前我国男性罹患恶性肿瘤中，胃癌一直是导致死亡的主要原因之一[1]。与日本、韩国病例相比较：我国临床上胃癌以中晚期多见(80% 以上)，5年生存率低(占35.1%)，与之早期胃癌诊断差距较大[2]，因此目前迫切需要提高胃癌早期诊断的手段。6个相同或相似的连接蛋白(Connexin CX)是细胞间隙连接(gap junction,GJ)的基本单位，组成传递细胞间的信号通道，传递细胞生长、分化及维持细胞正常稳态的信号。目前已经发现CX共21种，在身体组织细胞中广泛表达，其中在胃粘膜细胞广泛表达的有CX6、CX32、Cx43。其中Cx43与肿瘤关系最为密切。p70S6激酶(p70S6 kinase，p70S6K)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是AGC家族的重要成员之一，是mTOR下游的重要靶点之一，从而调控细胞内的转录与翻译、细胞生长周期、增殖与凋亡等[3]。在人体内p70S6K的异常表达，可导致肿瘤。目前针对有关Cx43与p70S6K在胃癌中的表达及相关性研究尚未见报道，本研究利用Western Bloting和qRT-PCR实验技术检测Cx43及p70S6K在胃癌中的表达情况，并分析其与胃癌临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料:2019年2月至9月在承德医学院附属医院收集60例新鲜胃癌标本，患者术前均未行放射治疗及化学治疗，所有标本均经病理证实为胃腺癌。留取癌灶及正常胃黏膜组织(距癌灶至少5cm以上)放置无酶冻存管内，迅速放置-80度冰箱保存用于WB及QRT-PCR实验，(本研究经伦理委员会审议通过)。

1.2主要试剂:①Western Bloting试剂：兔抗人Cx43多克隆购自杭州华安生物公司；兔抗人p70S6K 多克隆及β-antin兔单克隆抗体均购自武汉ABcolnal公司；羊抗兔二抗购自Redpartytech美国公司；快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自庄盟公司等；BCA试剂盒及ECL发光液均购自联科公司；RIPA购自索莱宝公司等。电泳液、转膜液及TBST试剂均由承德医学院提供。②PCR试剂：提取RNA试剂盒购自Foregene公司，逆转录试剂盒及扩增试剂盒购自武汉ABcolnal公司。引物由GeneCopoeia公司设计。

1.3Western Blot 方法及结果判读

1.3.1方法:取100mg新鲜胃癌及正常胃粘膜标本，经过RIPA裂解、震荡、离心等步骤提取组织中的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以20ug计算出蛋白上样量，制10%分离胶+5%浓缩胶，蛋白上样，以80v电泳，待样品溴酚蓝至分离胶后改为120v电泳，直至所需条带跑出。0.45μmPVDF膜甲醛激活后200mA低温转膜。将转膜好的PVDF膜放入5%脱脂奶粉孵育盒中摇匀封闭2h，加入一抗(β-actin 1∶100000、Cx43 1∶6000、p70S6K 1∶10000)摇匀2h后4℃过夜。次日，滴加二抗(1∶10000)摇匀约1h，TBST清洗，10min/次，共3～6次。将配制好的ECL发光液滴在轻度干燥的PVDF膜上，在暗室内进行显影，保存所需条带显影。

1.3.2结果判读:运用ImageJ软件测量条带的灰度值,目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.4qRT-PCR 方法及结果判读：RNA提取纯化、逆转录及扩增均严格按照试剂盒说明书进行无酶操作。结果：目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt。

1.5统计学方法:应用SPSS25.0统计软件检验实验数据属于非正态分布，故应用M(P25，P75)描述，组间比较采用独立样本Wilcoxon秩和检验。非正态分布应用Spearman进行相关性分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Cx43及p70S6K在不同胃组织中蛋白表达比较

2.1.1蛋白印迹实验显示：在蛋白水平，胃癌组织中Cx43及p70S6K蛋白相对表达量分别为M(0.39，0.98)，M(0.94，1.55)，正常胃黏膜组织中蛋白相对表达量分别为M(1.62，3.80)，M(0.54，1.02)由此说明在胃癌组织中Cx43的蛋白相对表达量低于正常胃黏膜组织，p70S6K蛋白相对表达量则高于正常胃黏膜组织，差异均有统计学意义(均P<0.01，图1)。

2.1.2qRT-PCR实验显示：在基因水平，胃癌中Cx43及p70S6K mRNA相对于正常胃粘膜组织中mRNA表达量分别为M(0.33，0.66)，M(2.14，4.14)，(均P<0.01)。由此说明，在胃癌组织中Cx43的mRNA相对表达量低于正常胃黏膜组织，p70S6K的mRNA相对表达量则高于正常胃黏膜组织，差异均有统计学意义(均P<0.01，图2)。

2.2在胃癌中，Cx43及p70S6K蛋白和mRNA 表达与临床病理参数之间的关系:随着胃癌恶性程度的增加、TNM分期加重、浸润深度的加深及有淋巴转移的胃癌组织中，Cx43蛋白及mRNA相对表达量呈逐渐下调趋势，而p70S6K蛋白及mRNA相对表达量则呈逐渐升高趋势，差异均有统计学意义(均P<0.05，详见表1，表2)。

2.3胃癌组织中Cx43及p70S6K蛋白和mRNA表达的相关性:在蛋白水平，胃癌组织中Cx43与p70S6K蛋白的表达成负相关(r=-0.746，P<0.01)；在基因水平，Cx43与p70S6K mRNA的表达成负相关(r=-0.759，P<0.01)。

2.4胃癌组织中Cx43与p70S6K蛋白及mRNA表达与临床病理参数之间的关系，见表1、表2。

表1 Cx43及p70S6K蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系(平均秩)

图1 在胃癌组织和正常胃黏膜组织中Cx43 及p70S6K的蛋白表达情况

图2 在胃癌组织和正常黏膜组织中Cx43及p70S6K mRNA的表达情况

表2 Cx43及p70S6K mRNA表达与胃癌临床病理参数的关系(平均值)

3 讨 论

在肿瘤中Cx43是GJ的重要连接蛋白之一，其表达的下调，可导致GJ功能缺失或下降，促进肿瘤的发生、发展。在许多肿瘤中通过上调Cx43的表达，可使GJ的功能的恢复，从而抑制肿瘤的发生、进展[4]。张立伟[5]等研究发现，在胃癌中抑制磷酸化的细胞骨架蛋白(P-Ezrin)能够减少Cx43的磷酸化，恢复GJIC功能。本研究显示：在胃腺癌中，分化程度越差、TNM分期越高、浸润胃壁越深,Cx43蛋白及mRNA的表达量均越低,这与张立伟[5]等的研究结果一致，进一步说明在胃癌中Cx43在基因水平及蛋白水平调控出现异常，并参与了胃癌的发生、发展。

P70S6K是PI3K/AKT/mTOR信号通路的主要下游作用靶物之一。在肿瘤中，p70S6K经过磷酸化才能活化，从而发挥功能作用，促进p70S6KmRNA翻译活性增强，协同刺激癌细胞蛋白质及核糖体合成,从而控制细胞从G1期到S期，促进癌细胞生长及增殖。许多研究表明[6,7]，在其他肿瘤中p70S6K呈过度表达，与本研究结果一致。本试验结果显示：p70S6K蛋白及mRNA 在胃癌中的表达量比正常胃粘膜组织中高，提示 p70S6K 在胃癌中高度激活。在低分化、TNM分期为III和IV期、浸润胃壁达深肌层伴淋巴转移的胃癌患者中，p70S6K蛋白及mRNA 表达更高，这与陈瑞红[8]等研究一致，进一步证实了p70S6K参与了胃癌的发生和转移过程。根据本实验数据进行Spearman相关性分析，无论在蛋白水平还是基因水平，Cx43及p70S6K均呈负相关关系，这可能是在胃癌的发生、发展过程中，Cx43在基因水平出现表达下降，导致Cx43蛋白表达下降，从而使GJ功能下降或缺如，使细胞间传递细胞增殖、分化的信息出现失控，最终导致 p70S6K过度激活，刺激细胞过度增殖分化，导致胃癌的发生及转移。由此得出结论，Cx43及p70S6K在胃癌中的异常表达，参与了胃癌的发生、发展。推测是否可通过上调Cx43,使GJ功能恢复或增强，直接或间接使p70S6K在胃癌中表达下降，从而抑制胃癌的发生及发展。因此Cx43与p70S6K的联合检测，有望成为胃癌诊断治疗的新靶点。