灵芝多糖减轻蒽环类药物所致心肌细胞凋亡的研究

徐 繁， 李 潇， 李青山， 肖 旭， 张圣林， 姜海军， 赵 博， 肇 爽

(承德医学院附属医院， 河北 承德 067000)

乳腺癌为女性常见恶性肿瘤，而化疗为重要治疗手段之一，蒽环类药物为乳腺癌化疗过程中常见药物，以多柔比星(doxorubicin，DOX)为代表于20世纪70年代初开始应用于临床，但约10%的患者在停止化疗近10年后还会出现心脏疾病，由于心肌细胞为永久性细胞，被破坏后无法再生，若心肌细胞受到损伤，可能引起一系列不良症状，严重可危及生命，蒽环类药物致心脏毒性过程中细胞凋亡可能是其主要机制之一，而目前临床上常用维生素C、E联合蒽环类药物来减轻心脏毒性，但效果欠佳，因此寻找一个方便有效的药物成为研究热点。灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLPS)是中药灵芝的主要活性成分，具有清除氧自由基、抗肌炎、保护心脏作用，在本研究中我们用GLPS干预DOX致大鼠H9C2心肌细胞损伤，以探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料:RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)，购于HyClone Laboratories公司；Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(兔来源多抗)、二抗(羊抗兔IgG HRP抗体)，购于Proteintech公司(中国武汉)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、AV-PI检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，多柔比星、灵芝多糖(纯度99%)购于北京康泰合元生物公司。

1.2细胞培养及分组:H9C2细胞用含有10% FBS的RPMI-1640培养基于37℃、5% CO2的培养箱中培养，稳定后调整细胞浓度为5×104个/mL，将细胞分为5组，分别为：对照组、GLPS高剂量组、DOX组、GLPS低剂量+DOX组，GLPS高剂量+DOX组。细胞处理方法：对照组细胞只加培养基，GLPS高剂量组加入100ug/mL的GLPS与H9C2细胞共培养8h；GLPS低剂量+DOX组、GLPS高剂量+DOX组细胞分别加入50ug/mL、100ug/mL的GLPS与H9C2细胞共培养8h，然后在两组均加入1μM多柔比星继续共培养24h；DOX组细胞仅加入1μM多柔比星共培养24h，收集各组细胞待用。

1.3AV-PI法检测H9C2细胞凋亡:收集各组细胞重悬于0.3mL结合缓冲液中,加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化吡啶(PI)染液, 混匀, 室温避光孵育30min，将每管用缓冲液补足至500ul后上流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.4Western blot分析:收集各组细胞，使用BCA法测定蛋白质浓度，取20ul蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将已分离的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭1h，分别加入Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(用一抗稀释液将一抗按照1：1000稀释)4℃孵育过夜，再分别加入二抗(用二抗稀释液将二抗按照1：2000稀释)室温下2h，采用二氨基联苯胺显色, 进行灰度分析。

2 结 果

2.1H9C2细胞的凋亡率:AV-PI双染流式细胞术结果显示，GLPS高剂量组与对照组相比细胞凋亡率无统计学意义；DOX组细胞凋亡率与对照组相比升高42.98%(P<0.05)；与DOX组对比，50ug/mL和100ug/mL的GLPS预处理H9C2细胞，凋亡率分别降低6.22%和15.36%(P<0.05)，具有统计学差异。见图1。

图1 各组细胞凋亡率

2.2Western blot 法检测各组凋亡相关蛋白的表达水平:DOX组H9C2细胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表达明显高于对照组，Bcl-2/Bax比值明显低于对照组；GLPS低、高剂量+DOX组H9C2细胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表达明显低于DOX组，Bcl-2/Bax比值明显高于DOX组。见图2。

图2 (A)H9C2细胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表达；(B)H9C2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达；(C)各组H9C2细胞中Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP相对表达量；(D)各组H9C2细胞中Bax / Bcl-2蛋白表达水平比值的统计图

3 讨 论

蒽环类药物为临床常用抗肿瘤药物，而多柔比星为蒽环类药物的代表药物之一，其对心肌组织具有强力亲和性，引起心脏疾病，可能机制为药物进入心肌组织后使氧自由基堆积，抑制核酸及蛋白质合成，加速心肌细胞凋亡[1]，而如何将药物所致心脏毒性降到最低成为研究热点。灵芝中含有400多种不同活性物质，而灵芝多糖是其中质量比重最大的成分，近几年来对其研究众多。已有报道，灵芝多糖具有抗氧化、抗肿瘤、保护心脏等作用，但是否可缓解药物所致心脏毒性尚无报道。本研究采用GLPS预处理后用DOX诱导心肌细胞损伤，明确其功效。结果表明DOX可以增加大鼠心肌细胞凋亡，而灵芝多糖预处理后，心肌细胞凋亡率及促凋亡蛋白表达明显降低，抗凋亡蛋白表达率明显升高，提示我们，GLPS在一定程度上可以减轻DOX所致的心肌损伤，具有保护心肌的作用。

氧化应激会使ROS过多积累在细胞内，过量的ROS可损伤线粒体，从而介导线粒体凋亡途径；本实验之前预实验部分结果提示DOX干预后心肌细胞内ROS及细胞凋亡率显著升高，考虑DOX可使氧自由基生成增多，致细胞凋亡率升高，而GLPS可对此过程产生部分缓解作用。

caspase家族蛋白是死亡受体途径(细胞外途径)和线粒体途径(细胞内途径)的共同终末途径[2]。Caspase-3是执行细胞凋亡的核心步骤，cleaved PARP是细胞凋亡的标志，Caspase-8是启动细胞凋亡的关键。Bax和Bcl-2是Bcl家族成员，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值对凋亡途径起重要调控作用[3,4]。Bcl-2/Bax比值的增加能够激活下游细胞凋亡过程中关键的执行分子之一Caspase-3的表达，进而诱导细胞凋亡[5]。与此一致，我们发现GLPS预处理8h后下调了Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP的表达，Bcl-2/Bax表达率明显升高。综上说明,灵芝多糖可能通过调节Bcl-2家族蛋白,抑制活化后的caspase-3酶解切割PARP得到cleaved PARP,抑制DOX所致心肌细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用。

综上所述，灵芝多糖可以减轻蒽环类药物所致心肌细胞凋亡的发生,发挥保护心肌细胞的作用,然而这仅仅是众多机制中的一个环节,为针对多因素综合干预的药物或方法的研究提供一定的理论基础。