miRNA-21 miRNA-155和miRNA-195诊断乳腺癌间接比较的Meta分析

张敏杰， 郭团茂， 杨飞飞

(陕西省咸阳市中心医院， 陕西 咸阳 712000)

乳腺癌(breast cancer, BC)是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，随着疾病的进展，脱落的癌细胞一旦进入循环系统就会随血液或淋巴液散播全身，进而转移到身体各个重要脏器，威胁生命。目前用于乳腺癌诊断的手段主要有乳腺超声、乳腺钼靶X线摄影、乳腺磁共振成像、组织病理学检查、血清学标志物检测等。近年来，随着实时荧光定量PCR技术在miRNAs检测中的应用逐渐成熟，使得miRNAs极有可能成为BC诊断的新一代血清学标志物。已有大量的研究表明外周血循环miRNAs在乳腺癌筛查、诊断方面具有重要的价值。2005年，Iorio等[1]首次报道了人乳腺癌中miRNAs表达谱的改变，鉴定出了29种miRNAs存在表达失调现象。其中miRNA-10b、miRNA-125b 和miRNA-145表达明显下调，而miRNA-21及miRNA-155的表达则显著上调。Hannafon等[2]通过分离提取16名无乳腺癌病史的健康妇女和16名乳腺癌患者的血浆样本中外泌体总RNA，采用实时定量PCR技术分析几种特异性分泌的miRNAs，发现BC患者血浆外泌体中的miRNA-1246，miRNA-21表达与对照组相比明显上调。多个miRNAs的表达与乳腺癌的临床病理特征相关，miRNAs普遍存在于人体内，而与BC相关联的循环miRNAs种类较多，且表达量各有差异。我们大量检索国内外检测miRNAs对BC进行诊断准确性研究的诊断性试验，通过收集、汇总众多的研究之间已发表的相关实验数据，并进行系统性的分析，最终我们选取miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195以评价这三种miRNAs在乳腺癌诊断方面的价值。目前虽已有许多临床研究以术后组织病理检查作为金标准评价这三种miRNAs检测对BC的诊断价值，然而尚无各miRNAs之间相互比较的研究。在直接比较研究证据不足的情况下，本研究通过间接比较的方法借助已开展的组织病理检查来实现miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC诊断价值的间接比较，以期为后续研究提供数据支持。

1 资料与方法

1.1资料来源及文献检索策略:检索策略：以目标疾病、待评价诊断试验、诊断准确性指标拟定检索词并结合自由词最终确定中文检索词为：“乳腺癌”、“乳腺肿瘤”、“乳腺恶性肿瘤”、“外周血循环微小RNA”、“微小RNA”、“miRNA”、“miRNAs”、“诊断”、“敏感性”、“特异性”、“敏感度”、“特异度”。英文检索词为“breast neoplasm”、“breast tumor”、“breast cancer”、“miRNA”、“miRNAs”、“diagnoses”、“sensitivity”、“specificity”。资料来源：PubMed、EMbase、Medline、The Cochrane Library、中国生物医学文献检索数据库(Chinese Biological Medicine Database, CBM))、中国期刊全文数据库(China National Knowledge Infrastructure, CNKI)、万方科技期刊全文数据库、维普中文科技期刊全文数据库，检索时限从建库到2019年10月，语种为中、英文。同时手工检索其他相关文献并对纳入文献的参考文献进行追踪以补充获取更多文献，具体筛选过程见图1。

1.2文献纳入与排除标准:文献纳入标准：①研究类型：以组织病理检查为金标准，对BC进行诊断准确性研究的诊断性试验。②研究对象：经过组织病理检查组织类型明确为BC患者，且对照类型明确，不限制年龄、病因、种族。③诊断试验的方法:外周血(全血/血清/血浆)循环miRNAs表达对BC诊断价值的研究。④结局指标：合并敏感性、合并特异性、合并阳性似然比、合并阴性似然比、合并诊断优势比、绘制受试者工作特征(summary receiver operating characteristic，SROC)曲线并计算曲线下面积(area under curve，AUC)；miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195三个诊断试验间接比较的相对诊断比值比(relative diagnostic odds ratio, RDOR)结果。排除标准：①病例组为合并其他组织器官恶性肿瘤的患者，或者病例为复发、转移乳腺癌的研究。②无法获取BC四格表数据的研究。③数据资料有误或者数据不完整的研究；④同一作者或者研究单位对同一人群进行的重复研究或重复发表的研究。

图1 文献筛选流程及结果

图2 纳入研究的质量评价

1.3文献筛选、资料提取和质量评价:由2位作者通过逐篇阅读文献进行独立筛选并提取资料，双方同时纳入的文献采用QUADAS-2(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies-2)工具进行偏倚风险评价，存在分歧的文献最后共同协商处理。提取资料主要包括第一作者；发表年份；研究对象所在国家；病例的病理类型；对照类型；病例组与对照组样本总数；miRNAs检测方法；Cut-off值；样本类型；miRNAs的类型；四格表数据真阳性(true positivity，TP)、假阳性(false positivity，FP)、假阴性(false negativity，FN)、真阴性(true negativity，TN)。采用QUADAS-2工具进行偏倚风险评价，由2位作者独立使用修改后的QUADAS-2工具对所有研究进行评价，结果所得一致性较好。

1.4统计学方法:采用Meta-Disc1.4软件进行Meta分析，分别对miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195这3种诊断试验各研究间的阈值效应进行分析，通过计算敏感性的对数与(1-特异性)对数的Spearman相关系数检验，P<0.05提示存在阈值效应。运用Meta-Disc1.4软件分别对miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195各诊断试验内部各研究间异质性进行分析，通过计算诊断优势比(diagnostic odds ratio，DOR)的Cochran-Q值，I2值检验异质性。P>0.05，I2<50%则无统计学异质性，采用固定效应模型合并效应量。当P<0.05，I2>50%为存在统计学异质性，采用随机效应模型合并效应量包括：合并敏感性、合并特异性、合并阳性似然比、合并阴性似然比、合并DOR。采用RevMan5.3实现在同一个图形中呈现3个诊断试验的SROC曲线，以Meta-Disc1.4软件计算AUC。运用R软件的“netmeta”安装包实现miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195进行间接比较的RDOR结果。本研究是基于组织病理诊断的金标准比较各个miRNAs的间接比较，属于网状Meta类型中星形网状Meta分析，符合相似性条件，且不存在直接比较的数据不需要进行一致性检验。当RDOR结果的置信区间包含1时，提示2种诊断试验之间的差异无统计学意义。若A vs B，当RDOR>1且置信区间不包含1，则A的诊断价值较B大；当RDOR<1且置信区间不包含1，则A的诊断价值较B小，提示2种诊断试验之间的差异具有统计学意义。采用亚组分析异质性来源，采用Stata 12.0软件绘制Deek's漏斗图非对称检验评估是否存在发表偏倚，P<0.05为差异有统计学意义，表明存在发表偏倚。

2 结 果

2.1文献检索结果及纳入研究的基本情况:初检获得文献780篇，最终纳入文献17篇，具体筛选流程见图1。有关miRNA-21对BC诊断的原始文献9篇，中文3篇，英文6篇。BC组共计纳入患者为565例，对照组纳入受试者为432例；有关miRNA-155对BC诊断的原始文献6篇，中文1篇，英文5篇。BC组纳入患者为596例，对照组纳入受试者为236例。有关miRNA-195对BC诊断的原始文献5篇，中文3篇，英文2篇。BC组纳入患者为415例，对照组纳入受试者为319例。共计BC患者1576例，对照987例。17篇文献中Mar-Aguilar F[6]和Han J G[11]两篇文献同时对miRNA-21和miRNA-155进行检测。张文昭[10]等的研究同时对miRNA-21和miRNA-195进行检测。纳入研究的基本信息见表1。

2.2纳入文献质量评价和偏倚风险评价:本研究纳入文献的对照类型有BC高风险者、良性乳腺疾病患者和健康人。病例选择过程中3篇文献连续纳入病例[7,16,18,]；4篇文献中将非BC的患者纳入病例[4,5,8,10]；所有文献均为病例-对照研究；所有原始文献中纳入病例均经过组织病理检查确诊，因此17篇文献病例选择适用性评价均为“低不适用性考虑”。在进行待评价诊断试验评价中发现所有文献均未采用盲法对病例和对照miRNAs进行检测；有4篇[8,10,13,16,]文献无Cut-off值在适用性考虑中评价为“高不适用性考虑”，同时偏倚风险评价结果为“高风险”。对金标准部分进行偏倚风险评价，17篇文献均评价为“低风险”；有7篇文献明确说明BC病例的组织病理类型，适用性考虑评价结果为“低不适用性考虑”。所有原始研究均无失访者或遗漏病例。偏倚风险评价及适用性判断结果见图2。

2.3Meta分析结果

2.3.1miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC的诊断价值评估:纳入有关miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC诊断文献的Spearman相关系数分别为0.315(P=0.409)；-0.086(P=0.872)；0.300(P=0.624)提示定量评价无阈值效应。各诊断试验与金标准比较合并分析结果如下，采用固定效应模型对miRNA-21诊断BC的研究进行Meta分析，结果合并敏感性为0.73(95% CI 0.69～0.77)、合并特异性为0.86(95% CI 0.83～0.89)、合并阳性似然比为4.99(95% CI 3.86～6.46)、合并阴性似然比为0.34(95% CI 0.29～0.39)、合并诊断优势比(DOR)为15.18(95% CI 10.79～21.37)、SROC曲线下面积(AUC)为：0.885；采用随机效应模型对miRNA-155诊断BC的Meta分析结果:合并敏感性为0.81(95% CI 0.78～0.84)、合并特异性为0.85(95% CI 0.80～0.89)、合并阳性似然比为4.90(95% CI 2.33～10.31)、合并阴性似然比为0.16(95% CI 0.07～0.33)、合并DOR为44.22(95% CI 11.74～166.53)、AUC为：0.933。采用固定效应模型对miRNA-195诊断BC的Meta分析结果:合并敏感性为0.76(95% CI 0.72～0.80)、合并特异性为0.89(95% CI 0.85～0.93)、合并阳性似然比为6.59(95% CI 4.77～9.12)、合并阴性似然比为0.27(95% CI 0.23～0.33)、合并DOR为28.41(95% CI 17.98～44.89)、AUC为：0.910。miRNA-155诊断BC的SROC曲线下面积大于miRNA-21和miRNA-195的曲线下面积，提示miRNA-155的诊断准确性略优于miRNA-21和miRNA-195，见图3。

表1 纳入研究的基本资料

图3 miRNA-21、miRNA-195和miRNA-195诊断BC的SROC曲线

2.3.2miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195诊断BC进行间接比较的RDOR结果:以组织病理检查(histologically, HIS)作为共同的诊断标准，间接比较结果显示miRNA-155 vs miRNA-21的RDOR值为0.56(95% CI 0.19～1.70)；miRNA-195 vs miRNA-21的RDOR值为0.56(95% CI 0.18～1.74)；miRNA-195 vs miRNA-155的RDOR值为1.00(95% CI 0.28～3.63)。结果提示miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC的诊断准确性之间差异无统计学意义。见图4。

2.3.3异质性检验:非阈值效应引起的异质性检验结果显示，纳入miRNA-21诊断BC的9项研究DOR对应的Cochran-Q=13.85 (P=0.085 8)，I2=42.2%。纳入的各研究间无统计学异质性。纳入miRNA-195诊断BC的5项研究DOR对应的Cochran-Q=6.20 (P=0.184 9)，I2=35.5%。各研究间无统计学异质性。纳入miRNA-155诊断BC的6项研究DOR对应的Cochran-Q=27.16 (P=0.000 1)，I2=81.6%。按照以下因素进行亚组分析，寻找异质性来源：地区(分为“中国组”和“国外组”)；Cut-off值(分为“有Cut-off值组”和“无Cut-off值组”)；病理类型(分为“有分型组”和“无分型组”)。亚组分析结果未发现任何亚组之间存在显著差异。

图4 miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC诊断RDOR值调整间接比较森林图

2.3.4敏感性分析和发表偏倚:分别将纳入miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195诊断BC的文献中结果差异较大的文献或者样本量较大的文献剔除后再次进行Meta分析，3种诊断试验结果均无明显变化，说明3种诊断试验研究稳定性好，结果可信。分别对纳入3种诊断试验中的研究采用线性回归的方法检验是否存在发表偏倚，绘制Deek's漏斗图，结果纳入miRNA-21的9篇文献斜率系数的t=0.29(P=0.777)，无明显发表偏倚；纳入miRNA-155的6篇文献斜率系数的t=1.40(P=0.235)，无明显发表偏倚；纳入miRNA-195的5篇文献斜率系数的t=0.30(P=0.781)，无明显发表偏倚。

3 讨 论

MiRNAs是一类长度约为18～24个核苷酸的非编码小分子RNA，广泛分布于细菌、真菌、病毒颗粒、真核生物等生命体内。据统计，在人体内探明的miRNAs数量仅相当于编码基因的1%左右，但它却调控着人类约三分之一的基因。MiRNAs主要在转录后水平参与对靶基因的调控，每个miRNAs可对多个靶基因进行调控，而多个miRNAs也可协同起来调节同一个靶基因，因此其调节过程极为复杂。研究表明癌症诱发因素与原癌基因、抑癌基因之间的相互作用在癌症的发生、发展中起到关键作用[20,21]。乳腺癌的发生发展也是一个多基因改变的过程，受miRNAs的调控作用。研究发现miRNA-21通过作用于抑癌基因PTEN[22]及肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(tropo myosin 1，TPM1)[23]而促进肿瘤的发生发展。另有报道它也能直接作用于程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)与乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)而介导肿瘤的转移与侵袭[24]。然而miRNA-21在乳腺癌中的表达水平并不是一成不变的，整体上在血清样本中是上调的，按临床分期进行分析结果表明，在I期和IV期患者样本中上调幅度较大，而在Ⅱ期和Ⅲ期样本中上调的趋势则不明显[3]。除miRNA-21外，另有Heneghan H M[16]等的研究报道显示，与前列腺癌、肾癌、结肠癌等比较，外周血miRNA-195在乳腺癌患者中具有相对特异性表达，对其进行检测可以从其他种类的恶性肿瘤患者以及健康人中鉴别出乳腺癌患者。近期有研究表明，miRNA-155的过度表达与肿瘤的转移侵袭密切相关，其机制主要包括促进肿瘤细胞上皮-间质转化、抑制细胞凋亡等[25,26]。近年来，循环miRNAs作为肿瘤诊断和预后评价的分子标志不仅具有创伤小，方法准确、便捷的优势，并且其表达模式会随着癌症的进展而相应变化，因此被视为新一代的循环肿瘤标志，而BC患者血清miRNAs水平与临床病理的关系及其对诊断与预后预测的作用已成为目前的研究热点。本文通过对纳入的17项研究进行系统Meta分析，综合评价以组织病理检查作为参考标准对BC进行诊断准确性研究的诊断试验。通过计算合并诊断效应量、拟合SROC曲线、计算间接比较的RDOR结果并绘制调整间接比较森林图以评价miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195对BC的诊断效能，通过亚组分析探索纳入miRNA-155诊断BC的各诊断试验间的异质性来源，最后通过敏感性分析和检测发表偏倚评估本研究的可信度。结果显示：miRNA-155诊断BC的敏感性为81%，特异性为85%，合并DOR为44.22，AUC为0.933。表明miRNA-155对BC诊断价值优于miRNA-21和miRNA-195。但纳入的6项研究间存在高度异质性(81.6%)。经Spearman相关系数检验，异质性与阈值效应无关。进一步进行亚组分析，未发现任何亚组之间存在显著差异。我们采用RevMan5.3实现在同一个图形中呈现3种诊断性试验的SROC曲线图，结果显示miRNA-155诊断BC的SROC曲线下面积大于miRNA-21和miRNA-195的曲线下面积，提示miRNA-155的诊断准确性优于miRNA-21和miRNA-195，但是该图仅能进行直观的描述性分析，未能进行定量比较。因此，我们以组织病理检查作为共同的诊断标准，通过计算miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195两两之间的RDOR值实现三者之间的间接比较。RDOR值调整间接比较森林图显示miRNA-155对BC的诊断准确性与miRNA-21和miRNA-195的诊断准确性之间的差异无统计学意义。为评价纳入各个诊断试验中研究的稳定性，本文每次剔除1篇文献后，计算各个诊断试验合并DOR值，结果均未发生明显变化，提示本研究受单个文献的影响较小，同时Deek's漏斗图结果显示3种miRNAs诊断试验均无明显发表偏倚说明本研究分析结果稳定可靠。由于诊断试验准确性网状Meta分析统计学方法尚未完善，我们未能提供纳入各研究之间的相似性结果、总体异质性的结果。因此更合理可靠的结论还需要依靠诊断试验准确性网状Meta分析统计学方法的发展与成熟以及相关软件的研发。

通过采用Meta分析和基于组织病理检查作为共同参考标准的间接比较方法评价miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195在BC诊断中的临床价值。结果显示三种miRNAs均具有较高的临床诊断价值，有望成为BC诊断的新一代血清学标志物。