补肾活血软坚方对大鼠冠脉微血管病变内皮损伤相关因子NO、ET-1的影响*

张 萌 李 明 张 莉 苗 鑫 张 明 李湘奇

山东第一医科大学第二附属医院，山东 泰安 271000

随着冠心病PCI术后无复流现象、慢血流现象及心脏X综合征研究的不断深入，心脏冠脉微血管病变越来越受到重视。欧洲心脏病学会(ESC,European society of cardiology)发布的指南指出[1]在注意冠脉大血管病变的基础上，加强关注冠脉小血管及微血管病变在发病机制中的作用。冠脉微血管功能障碍是内皮功能紊乱、微血管收缩、微血栓形成及神经刺激的肌源性收缩等多方面因素导致的。本次实验采用向左心室注射月桂酸钠建立大鼠冠脉微血管内皮损伤动物模型，给予中药药物干预，通过观察大鼠心肌病理及血清内皮损伤代表性指标NO、ET-1变化情况，揭示中药方对冠状动脉微血管病变内皮功能损伤的相关影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性健康Wistar大鼠，体重(240±20)g，7周龄，采购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，在山东省第一医科大学实验动物中心动物室喂养，预养一周后开始实验。

1.2 实验药品和试剂

1.2.1观察药物 补肾活血软坚方由仙灵脾15 g，黄芪15 g，川芎5 g，地龙5 g，桃仁5 g，牡蛎15 g，泽泻5 g等组成。中药饮片购于山东省第一医科大学第二附属医院药剂科，根据前期补肾活血软坚方研究经验，按处方比例称取中药材，加适量水，煎煮2次，水煎液混合过滤浓缩，调整浓度为每毫升药液相当于生药4 g。

1.2.2对照药物 喹那普利，哈药集团制药总厂，国药准字H19990330，10 mg/粒。

1.2.3ELISA试剂盒(康利生物科技有限公司)、月桂酸钠粉剂 (天津市百世化工有限公司)、1%戊巴比妥钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、肝素钠注射液2 ml：12500 iu×10支/盒(常州千红生化制药有限公司)、80万u青霉素钠(石家庄石药集团中诺药业有限公司)。

1.3 实验器材

1.3.1实验器械 3K30高速离心机(德国Sigma公司)、超低温-80 ℃冰箱(中科美菱低温科技有限公司)、小动物呼吸机(ALC-V8型动物呼吸机，上海奥尔科特生物科技有限公司)、电子秤(津00000287，型号：TD6001A，精度：0.1g)、灌胃针(规格：16号，8 cm，北京中昊万通科技有限公司)、高精度天平(梅特勒-托利多公司，AB265-S)、光学显微镜及图像观察系统。

1.3.2其他器械及辅料 气管插管套管，眼科直剪，蚊氏止血钳，巾钳，开胸器，大鼠实验解剖台、镊子、手术刀片、弯剪、直剪、防凝管、缝针、量筒、小针刀、皮拉钩、吸引器、0.1 ml安全注射器、20 ml注射器、无影灯等。 棉签、棉球、无菌纱布、绷带、胶布、5%碘伏、75%酒精、乙醇、骨蜡、0.9%生理盐水、蒸馏水(山东省第一医科大学药理实验室提供)。

1.4 方法

1.4.1造模方法

根据冠状动脉微血管病变动物建模方法评估[2-3]选用注射月桂酸钠法造模，造模处理：造模组大鼠称重，给予腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉，大鼠取仰卧位解剖台固定，常规备皮，严格消毒，于大鼠颈部正中切开皮肤，钝性分离，暴露气管，气管插管成功后，连接ALC-V8小动物呼吸机辅助通气，选择大鼠左侧胸部第2肋间，贴近胸骨左缘纵向切开肌肉，暴露胸肋骨，自上而下剪断第2、3、4肋，暴露大鼠主动脉，用开胸器将大鼠胸腔左右扩开，暴露心尖部，将0.1 ml安全注射器沿心尖部刺入左心室，注入月桂酸钠1 mg·kg-1，后迅速夹住主动脉升部与弓部连接处10 s，使注入左心室的月桂酸钠能顺利流入冠状动脉。完成操作后将心脏放回胸腔，观察大鼠心跳平稳再逐层缝合，呼吸平稳后拔除气管插管。术后3 d常规给予青霉素40万单位腹腔注射预防感染，动物清醒后入笼饲养。假手术组手术方式与造模组相同，但不注入月桂酸钠。术后3 d连续肌肉注射青霉素预防感染。大鼠活动后心电图肢体导联出现ST段水平下移0.1 mv为造模成功。

1.4.2分组及给药

将SD大鼠60只按随机数字表法随机抽取假手术组15只，其余为造模组45只，造模组行月桂酸钠注入造模，非造模组行假手术，造模过程中假手术组死亡1只，造模组死亡2只，造模成功43只，再随机分为4组，分别是：假手术组、模型组、喹那普利组、中药组，以假手术组为对照组。4组在造模成功后第2 d开始药物干预，用药组分别给予喹那普利2mg/(kg·d) 、补肾活血软坚方15 g/(kg·d)灌胃，假手术组、模型组给予同等剂量蒸馏水灌胃，每日一次；实验剂量采用魏伟《药理实验方法学》选择临床等效剂量转换而成(按单位体重来算，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍)。造模第1天开始给予药物干预，于造模后第28天，将相应组的大鼠注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，各组大鼠腹主动脉取血，并处死取心脏，动脉血立即离心(3600r·min-1，10 min)，分离血清，分装后密封保存，备用。心脏固定保存备用。实验过程及动物处死均符合实验动物伦理标准。

1.4.3实验指标及指标测定

1.4.3.1心肌苏木素-伊红(HE)染色 将各组心脏沿纵轴切开，心肌组织用低高浓度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，脱蜡、HE染色、梯度酒精脱水、透明、固封。

1.4.3.2采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠血清中NO、ET-1的水平。严格按照试剂盒标注方法进行检测。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 模型建立情况

采用向左心室注射月桂酸钠法致大鼠冠脉微血管内皮功能损伤，共造模45只，肢体II导联心电图ST段下移0.1 mv为建模成功，造模成功43只，再随机分为三组，模型组14只，中药组14只，喹那普利组15只。假手术组手术死亡1只，共14只。经统计分析，组间对比未见明显差异。(P>0.05)

2.2 各组大鼠心肌形态学观察

假手术组：大鼠心肌组织未见炎细胞浸润及坏死心肌组织；模型组：心肌组织大量炎细胞浸润，心肌组织排列紊乱，纤维断裂，坏死组织周围有大量肉芽组织浸润；喹那普利及中药组：心肌组织少量炎细胞浸润，病变周围组织坏死组织较模型组减少，心肌细胞排列较整齐。(附图1)

图1 28d各组大鼠心肌形态学观察

2.3 大鼠血清NO及ET-1水平

与假手术组大鼠血清NO比较，模型组大鼠血清NO明显减少(P<0.01)，ET-1明显升高(P<0.01)；与模型组比较，中药组血清NO明显升高(P<0.01)，ET-1明显减少(P<0.01)；与喹那普利组比较，中药组血清NO明显升高(P<0.01)，ET-1亦升高(P<0.05)。结果见表1。

表1 28d各组大鼠血清NO、ET-1水平

3 讨 论

王贤良、苏立硕等研究[2]：微血管性冠心病的发病与冠脉内皮功能紊乱导致冠脉舒张储备不良和异常收缩有关。冠脉微血管病变的体内研究证实[4]冠脉小动脉的特定调节机制存在空间分布的异质性。即使在正常冠脉血流情况下，微血管舒张在空间分布中也是不一致的，这种异质性现象的产生提示冠脉微血管的调节存在复杂的、多方面的、与局部代谢密切相关的机制。Turnipseed等[5]发现冠脉阻力动脉和小动脉的扩张是内皮依赖性的并由NO介导。Deanfield JE等人通过小鼠实验证实[6]：内皮素-1可引起血管内皮功能障碍，并导致血管结构重塑。NO和ET-1是最经典、最具有代表性的指标，在微血管病理状态中，NO和ET-1是相互关联的，它们分别代表舒张及收缩的两种状态的因子，NO/ET-1比值大小综合反映微血管的收缩及舒张状态，比单一因子在解释复杂病理中更有优势。有实验[7]研究NO和ET-1平衡关系在X综合征发病中的作用,发现X综合征患者运动负荷高峰时NO有下降趋势，ET-1有升高趋势，其比值明显降低。NO/ET-1平衡的失调能综合的地反映内皮细胞功能的受损程度[8]。有研究证实[9]：血管紧张素Ⅱ可促进冠脉收缩，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可直接调节冠脉微血管壁的张力，改善内皮功能，从而促进冠脉舒张。通过动物实验证实[10]ACEI可以明显的降低ET-1的水平。Pauly等[11-12]发现喹那普利可改善实验动物冠脉微血管痉挛，改善微血管内皮功能，但在临床实验中却不能完全复制这种趋势。

中医认为本病的病机为本虚标实，其病变部位在心之络脉，冠脉微血管和络脉在功能、病变治疗方面具有密切相关性，吴以岭等人提出“孙络-微血管”这一概念[13]并指出：虽然各脏器组织的脉络病变有着不同的疾病表现形式，但不同组织的脉络却有着共同的病理基础即“孙络-微血管”病理改变。以“孙络-微血管”为概念基础，结合临床中医药治疗冠脉微血管病变的经验，通过中医理论得出冠脉微血管病变为：血瘀、痰结、络积，人身元气即是肾气，肾气为先天之本，赖后天以培，随年龄增长，肾气渐乏，出现全身不足之态，冠脉微血管为心之络脉，经属少阴，气血运行根本在于肾气的鼓舞，心气推动。本方在补阳还五汤基础方基础上加入补肾之仙灵脾，软坚散结之牡蛎，及利湿浊之泽泻。其中黄芪为君药补养元气，川芎、牡蛎为臣药活血软坚，当归、桃仁、仙灵脾为佐药在心肾气推动下活血散瘀，泽泻去痰湿，地龙为使药，引诸药入络脉中，又有通络作用。诸药合用共同作用于心之络脉，补元气之虚，通络脉之结滞痰积，改善冠脉微血管内皮功能。

通过本次实验，我们重点研究补肾活血软坚方对冠脉微血管病变内皮损伤相关因子的作用，在本次实验数据中我们发现：用药28d后，心肌病理切片显示：补肾活血软坚方在改善微血管损伤引起的心肌坏死及周围炎症方面有明确的作用。与喹那普利组比较，补肾活血软坚方在增加血清NO方面作用更加明显，而在降低ET-1方面后者更胜之。究其原因我们认为：①冠脉微血管病变内皮损伤因子较多，本次选择NO、ET-1虽具有代表性，但是仍然单一；②中药组对于冠脉微血管病变内皮损伤发挥作用可能是多维度的，与喹那普利单一机制不同；③中药组改善冠脉微血管内皮损伤可能需要更长时间。结论：大鼠冠脉微血管内皮功能损伤，血清NO明显降低，ET-1明显升高；补肾活血软坚方可增加血清NO，减少ET-1水平，改善微血管病变内皮功能；在实验28 d内，补肾活血软坚方对冠脉微血管病变内皮损伤的作用与喹那普利相当。补肾活血软坚方对冠脉微血管病变的作用可能还有其他机制，需要进一步研究。