食品中志贺菌检测能力的验证分析

刘兵

（宜春市袁州区疾病预防控制中心 江西宜春 336000）

1 前言

考虑到进出口食品和日常食品中志贺菌检测的重要性和必要性，国家相关部门对食品中志贺菌的检测方法进行了修订[1]。 为确保实验室正确使用新方法，以提高检验水平来获得可靠数据，宜春市袁州区疾病预防控制中心实验室进行了志贺菌在食品中的检测，并对检测能力做了研究。

2 材料与方法

2.1 材料和仪器

材料：志贺菌样品（江西省疾病预防控制中心提供）；福氏志贺菌、志贺菌增菌肉汤—新生霉素、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂、麦康凯琼脂（青岛海博生物技术有限责任公司）；4 种多价诊断血清（宁波）。

仪器：显色培养器、生化鉴定套装（青岛海博生物技术有限责任公司）；生物安全柜（江苏苏净安泰有限公司）；智能厌氧系统（德国）。

2.2 方法

样品准备：本次试验以疑似含有待测菌的冻干粉为能力验证样品，将其置入2℃～6℃的环境中存放，尽量在短时间内完成检测。

原液制备：在无菌条件下打开西林瓶，在60 s 内置入2～4 mL 生理盐水予以水化，制成40 mL 稀释液，将溶解过的稀释液吸出，置于无菌瓶，用剩余稀释液冲洗西林瓶内壁，在无菌瓶内放置清洗液，作为待测样本原液，整个过程不应超过20 min。

3 检验方法和结果

所有检验均以国家标准规定为依据，对照物为标准菌株。

3.1 增菌

在无菌条件下吸取25 mL 水化后的原液，置于锥形瓶（内含225 mL 志贺菌增菌肉汤），摇晃均匀，在42℃的条件下厌氧培养18 h。

3.2 分离和形态学观察

在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、麦康凯琼脂平板和显色培养基平板上分别接种增菌后的菌液，放置于35℃～37℃条件下培养20～25 h，对菌落在不同平板上的生长状态进行观察。

麦康凯琼脂上的菌落呈现出无色或浅粉色，圆形，半透明状，光滑、边缘整齐度不等，经观察，可见半透明、湿润、光滑、边缘整齐的A 菌和不透明、光滑、边缘整齐的B 菌。

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂菌落呈现为粉色至无色，半透明状，湿润、光滑、边缘整齐度不等，存在C 菌（半透明、无色、光滑、边缘整齐）和 D 菌（不透明、黄色、中心可有黑色菌落，不典型，予以排除）。

显色培养基上为白色菌落，培养基呈现为紫红色，菌落有2 种：蓝绿色，培养基黄色，疑似产气肠杆菌，标为E 菌，予以排除；菌落黄色，培养基变黄，疑似大肠杆菌或沙门菌，标为F 菌，无可疑菌落。

3.3 初步生化鉴定

将 A 菌、B 菌、C 菌、D 菌和标准菌株分别与三糖铁琼脂、半固体和营养琼脂斜面接种，在35℃～37℃的环境中培养20～24 h，观察并记录结果，详见表1。

3.4 生化试验和附加试验

生化试验用生长在经过培养的营养琼脂上的菌苔完成，结果显示4 种菌的生化反应与志贺菌生化特征不一致。鉴于部分菌素发酵棉子糖迟缓，可延长培养时间至48～72 h，靛基质培养时间延长至48 h，详见表2。

表1 初步生化鉴定结果

表2 生化试验及其附加试验结果

3.5 血清学鉴定

在玻片上划出2 个大小为1 cm×2 cm 的区域，挑取待测菌落置于2 个区域上方，左、右2 个区域分别滴入1 滴生理盐水和1 滴4 种多价诊断血清。 使用无菌接种环将菌落碾成乳状液，倾斜玻片，晃动1 min，观察黑色背景。结果显示4 种菌无凝集反应，为阴性；标准菌株有凝集反应出现，为阳性。

4 讨论

志贺菌是革兰阴性菌的一种，是最常见的细菌性痢疾病原菌，也被称作痢疾杆菌，在琼脂上培养24 h 后形成直径约2 mm 的光滑菌落，是肠道致病菌之一，可导致细菌性痢疾[2]。 志贺菌可使敏感人群中极少数个体出现此病，经食物传播，在人体外存活能力较差，在10℃～37℃的水中可存活3 周，在水果、蔬菜和牛奶中存活时间相对较短，1～2 周不等，光照0.5 h 后可被杀灭，耐寒性好，可在冰块中存活3 个月。 志贺菌食物中毒主要是由福氏志贺菌和宋内志贺菌引起。 一项关于志贺菌的菌型分布调查显示[3]，国内较为常见的志贺菌以福氏菌为主，其次为宋内菌，痢疾志贺菌和鲍氏菌相对少见。 因此，需掌握菌群分布与菌型变迁情况，以制备疫苗，预防痢疾。

细菌性痢疾是肠道传染性疾病中最常见的类型，以患者和带菌者为传染源，通过被污染的水源和食物经口传染[4]。 通常情况下，痢疾志贺菌所致病情较重，宋内菌所致病情较轻，分为急性细菌性痢疾和慢性细菌性痢疾2 种：后者多由前者治疗不彻底所致，或在机体营养状态不佳、抵抗力下降或合并其他慢性病的状态下发病。其致病机制为：志贺菌菌毛粘附于结肠黏膜上皮细胞和回肠末端，经侵袭蛋白进入桑普细胞，繁殖于黏膜固有层导致感染，痢疾杆菌致病能力强，内毒素强烈，在肠壁上发挥作用，提高其通透性，使得内毒素被机体吸收，导致发热、神志不清和中毒性休克等症状，也可破坏黏膜，引发炎症和溃疡；也能在直肠括约肌上发挥作用，引起腹痛、里急后重症状[5]。 外毒素，可有神经毒性、细胞毒性和肠毒性生物活性。

本文研究未发现志贺菌，证实被测样品安全。此次能力验证，使得实验室菌株检测能力大幅度提升，既积累了丰富经验，也发现了其中的不足之处，具体问题有以下3 点：（1）未在生化试验组进行氧化酶试验和革兰染色检查，可将该步骤作为筛查指标，使得试验结果更加有可信度。（2）对照物为标准志贺菌菌素，结果显示靛基质和棉子糖无明显生化反应，因此考虑选择试验API 试纸条。它是一种标准化的生化实试验，是公认的微生物生化鉴定金标准，相比于生化管鉴定方式，稳定性强，操作方便，但成本较高。（3）本文未进行血清学分型，可在下一步研究中配齐不同菌群多血清，与生化试验及其附加试验结果结合，以增加菌属血清学分型的可信度。