重组酶聚合酶扩增技术检测霍乱弧菌

蒋丽婷 孙浩洋 赵培静 周广彪 杨础华 梁希扬

（1.广州市微生物研究所有限公司（广州工业微生物检测中心） 广东广州 510663；2.广东省海洋工程职业技术学校；3.汕头海关）

1 前言

霍乱弧菌是一种革兰阴性菌，在虾、蟹、牡蛎等甲壳类及贝类水生动物中广泛存在，可引起烈性肠道传染病霍乱，发病急、传染性强且病死率高，曾在世界上引发多次大流行，是对人类危害极大的一种食源性致病菌[1，2]。 1817 年至今，历史上共发生 7 次霍乱大流行，造成数百万人的死亡，霍乱被列入国际检疫传染病，在我国被列为甲类法定传染病。 霍乱在我国南方相对多发，政府每年都会投入大量的人力、物力进行霍乱防控，因此霍乱弧菌的快速、高效检测在公共卫生防疫方面具有极其重要的意义[3，4]。

目前，传统选择性培养基分离培养鉴定法仍是霍乱弧菌检测的主要方法，先增菌培养后结合生化及血清学方法进行鉴定，这种方法虽然检测结果准确，但却存在操作烦琐、检测效率与检测灵敏度低、检测目标单一且耗时长等缺点，为实现霍乱弧菌等致病菌的快速检测，技术人员建立了酶联荧光免疫检测法、胶体金试纸条法、API 生化鉴定试纸条法、实时荧光聚合酶链式反应（PCR）、环介导恒温扩增（LAMP）等方法。其中，实时荧光PCR 及其他相关的改良方法如双启动寡核苷酸引物-聚合酶链式反应（DPO-PCR）法等以其灵敏度高、操作简便快捷等显著优势，近年来在霍乱弧菌、拟态弧菌等致病菌的检测中，得到越来越广泛应用[5]，但是荧光检测相关设备存在售价偏高、引物探针设计要求较高、产物片段偏小等缺陷，在很大程度上限制了其推广应用，基层实验室及非实验室环境下现场检测的推广应用更是受到了极大限制。

重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是继LAMP 之后的另一种等温核酸扩增技术，具有反应时间短、恒温实现核酸的解链和退火、检测结果易辨识等优点[6]。本研究拟根据编码霍乱弧菌外膜蛋白（ompW）的基因保守序列，设计霍乱弧菌RPA 检测引物，构建了一种霍乱弧菌的RPA 检测手段，并验证该方法的灵敏度、特异性，从而建立一种高效简便、灵敏度高、特异性强并适用于现场应用检测的技术方法。

2 试验部分

2.1 材料与仪器

材料：霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、金黄色葡萄球菌、河流弧菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、沙门菌、哈维弧菌、单增李斯特菌等标准菌株（中国科学院水生生物研究所）；电泳级琼脂糖、DNA Marker 及显色剂（宝生物大连生物技术有限公司）；RPA 扩增试剂盒（TwistDX 公司）；DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。

仪器：核酸蛋白分析仪（ND-1000，Thermo fisher公司）；凝胶成像系统（Tanon-1600，天能公司）；PCR扩增仪（Veriti，ABI 公司）；电泳仪（DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）。

2.2 试验方法

2.2.1 基因组DNA 提取

按照传统国家标准方法先对标准菌株进行复壮增菌及生化鉴定， 再参照检测试剂盒中的操作流程，提取上述增菌液的基因组DNA，最后再使用核酸蛋白分析仪对DNA 纯度及浓度进行测定，并统一稀释至 100 ng/μL 备用。

2.2.2 引物设计

参照RPA 的引物设计操作方法，结合霍乱弧菌ompW 基因的保守序列，采用引物设计软件（Oligo V6.22），对引物进行设计和筛选，再采用NCBI 的引物设计和特异性检测工具（Primer Blast），对入选的序列进行特异性确认，委托上海生物工程技术有限公司进行合成[7]。 最终设计检测霍乱弧菌RPA 检测引物的扩增产物为280 bp，具体序列为：上游引物：5′- GAAGGTGACTTTATTGTGCGCGCGGGTATTGCC-3′；下游引物：5′-CACCAAAGTAGTATTGGACCAT AAAGGTAGGT-3′。

2.2.3 方法建立

以提取的标准菌株基因组DNA 为模板，采用设计的引物进行RPA 扩增，阴性对照为超纯水，测定在恒温（37℃）及 30、40、50、60 min 反应时长下的扩增效果。

配制RPA 扩增体系方法为：将再水化缓冲液29.5μL，上、下游引物各 2μL（终浓度为 0.4μmol/L），去离子水 12.5 μL 以及模板 DNA 1 μL 分别加入含有0.2 mL 冻干酶粉的Twist Amp 反应管中，最后加入醋酸镁溶液 2.5 μL（280 mmol/L）。

反应结束后，将50 μL 苯酚/氯仿溶液加入到RPA扩增产物中，充分混匀，然后在12 000 r/min 转速下离心2 min，取5 μL 上清液点样于1.5%琼脂糖凝胶，使用1×TBE 缓冲液在5 V/cm 条件下进行恒压电泳40～60 min，最终在凝胶成像系统上观察结果。

2.2.4 特异性评价

按照RPA 检测方法，对11 种标准菌株的基因组DNA 进行检测，并评价所建立RPA 检测方法的特异性。

2.2.5 灵敏度评价

将提取的霍乱弧菌基因组DNA 进行10 倍梯度稀释（稀释成5 个稀释度），并以稀释后的DNA 为模板，按照RPA 检测方法进行方法灵敏度测试，并与魏霜等[8]建立的检测霍乱弧菌的DPO-PCR 方法进行灵敏度比较，引物序列ompW-F：5′-CGCTCCTGT ATTTGCTCACCAAGIIIIIGACTTTATTGTG-3′；ompW-R：5′-GAGCATTAATCAAAGCCAACGTTAIIIIIAAGT CCCCAT-3′，扩增产物长度为 463 bp。

2.2.6 应用效果评价

选取水质监控样本及金昌鱼、冻凤尾对虾、冻虾仁、活青蟹、冻牡蛎检测留样样品50 份（其中霍乱弧菌阳性样品5 份），按照建立方法对霍乱弧菌进行检测，以结果的一致性来评价方法的应用效果。

3 结果

3.1 RPA 检测方法的构建

按照RPA 检测方法，测得的不同扩增时长的RPA 检测效果详见图1。检测结果显示，检测时长在40 min 时就可以达到比较理想的扩增效果，ompW扩增条带与预期目的条带的大小一致，约280 bp，而超纯水阴性对照没有条带，结果表明，ompW 基因通过采用建立的RPA 检测体系可以被准确检测到。

3.2 RPA 检测方法的特异性评价

从ompW 的RPA 特异性评价结果可以看出，霍乱弧菌可以检测到280 bp 的特异性条带，而副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、金黄色葡萄球菌等其他10 株标准菌株均未检测到条带，说明该方法特异性较强，详见图2。

图1 RPA 技术检测ompW 基因的扩增时长结果

图2 ompW 基因的RPA 特异性检测结果

3.3 RPA 检测方法的灵敏度评价

RPA 检测方法的灵敏度测试结果详见图3。 结果表明，在反应时间为40 min，DNA 含量为0.1 ng 时，RPA 检测方法可以检测到280 bp 大小的目的条带，该灵敏度结果与魏霜等建立的检测霍乱弧菌owpW 基因的DPO-PCR 方法一致；而在DNA 的含量为0.01 ng时，RPA 方法与PCR 方法都不能扩增到目的条带，这种结果表明，RPA 检测方法可以实现与PCR 检测方法相当的灵敏度。

3.4 RPA 检测方法的应用效果

采用建立的RPA 检测方法， 对50 份留样样品进行检测， 检测结果表明，RPA 检测方法与传统增菌培养及生化鉴定结果完全一致，表明RPA 方法测定霍乱弧菌结果准确，应用效果良好。

4 讨论

图3 ompW 基因的RPA 检测灵敏度

周广彪、凌莉等[9，10]曾采用 RPA 技术建立针对拟态弧菌、创伤弧菌特异性基因的检测方法，并对样品进行了应用测试，结果表明该方法在灵敏度、特异性及应用检测等方面都能较好实现预期效果。 为测定RPA 检测方法对其他致病菌的检测效果，以更好应用于水生动物及其加工制品多种致病菌的检测和监控监测，本研究进行了霍乱弧菌的RPA 检测的研究，并同时进行了应用效果的验证。

灵敏度及特异性是评价检测方法优劣的关键性参数，本研究建立的RPA 检测方法特异性强，灵敏度与普通PCR 方法及LAMP 方法相当， 但RPA 方法相比普通PCR 方法，反应更为快速，且该方法无需依赖PCR 仪，更易满足基层单位和现场检测的需要。 而相比于LAMP，RPA 技术的引物设计难度更小、产物片段单一，且便于后续进行测序确证，因而具有更高的使用价值。

RPA 技术作为一种新兴检测手段，在发展过程中还存在一些地方需要完善，例如，试剂成本相对较高，对蛋白活性要求较高，且在电泳前需纯化去除蛋白等。 但RPA 技术作为一种后起的核酸扩增技术，由于其方便快捷、灵敏度高、特异性强等优点，正被越来越多得用于病原体检测及食品安全性检测等领域，具有广阔的技术发展及应用前景。