TAT-SOD 在长期保藏的重组毕赤酵母中表达的条件优化

李孔翰， 陈玲琳， 周建森， 刘树滔

（福州大学 生物工程研究所，福建 福州 350002）

超氧化物歧化酶 （Superoxide Dismutase， 简称SOD）是一种含金属的、人体最重要的抗氧化酶，它在维持机体自由基产生和消除之间的动态平衡方面起着重要作用[1]。 SOD 可分为 CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 等 3 种类型。 其中 CuZn-SOD 分布最广，广泛分布于细胞质、细胞核、过氧化物酶体及线粒体膜间隙中， 对防御内源性和外源性活性氧毒性、预防衰老以及炎症等方面有重要意义[2-5]。 目前CuZn-SOD 虽然已在食品、医药、化妆品等方面有所应用，但由于它是大分子蛋白质，细胞膜通透性差。这限制了SOD 的实际应用。 TAT-SOD 是TAT 蛋白转导结构域与CuZn-SOD 的融合蛋白质， 其中的TAT 片段可实现蛋白质的跨膜转导功能[6]。 TATSOD 作为独特的新型抗氧化酶，改善了细胞膜通透性差的问题，因此具有较大的应用潜力[7]。

巴斯德毕赤酵母作为甲醇营养酵母，近年来被公认为最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一[8]。 作者所在实验室的陈莹等 2007 年构建了TAT-SOD 的重组毕赤酵母表达菌株，实现了TATSOD 在该菌株的高水平表达[9]。 由于发酵条件（包括pH 值、培养温度、溶解氧、甲醇浓度、诱导时间等）的优化是提高外源蛋白质在毕赤酵母表达水平的重要手段， 陈躬瑞等对摇瓶发酵条件进行优化，使SOD 酶活水平从 289 U/mL 提高到 475 U/mL[10]。 类似，张海玲等使用毕赤酵母密码子的偏好性构建了能高效分泌表达人源CuZn-SOD 的毕赤酵母工程菌，用来优化表达以提高产量[11]。郑屹峰等通过摇瓶实验，研究了不同因素对人CuZn-SOD 在毕赤酵母中表达的影响[12]。 但这些研究对SOD 表达优化的内在机制， 如目的基因转录水平的差异尚未深入分析。 另外，表达菌株可能因长期保藏而发生退化，目前很少对长期保藏菌株表达目的蛋白质的优化条件进行研究。 作者以2007 年构筑并长期保藏在-20 ℃的TAT-SOD 重组毕赤酵母菌作为出发表达菌株，研究摇瓶实验的诱导剂体积分数、诱导温度、初始pH 等因素对发酵菌株的生物量、TAT-SOD 的蛋白质表达水平和酶活的影响， 并通过荧光定量PCR 测定目的基因的mRNA 的表达水平等方法分析优化表达的内在机制，以期更大程度地获得目的蛋白质，为TAT-SOD 的产业化生产条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

-20 ℃低温长时间保存表达TAT-SOD 菌株Pichia pastoris X33：福州大学生物工程研究所提供。

1.2 仪器设备与药品

高速离心机Avanti TMJ-251：日立公司；紫外分光光度计型号U-1900：日本HITACHI 公司；蛋白质电泳仪： 日本 ATTO 公司； 恒温培养振荡器（ZHWY-200B）：上海智城分析仪器有限公司；Yeast Extract 和 Tryptone：OXOID 公司；盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、甲萘胺、冰醋酸、甘油、葡萄糖等：均为分析纯， 国药集团化学试剂有限公司； 黄嘌呤氧化酶：Roche Diagnlstics 公司。

1.3 培养基

种子液培养基YPD（组分g/L）：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖10；摇瓶诱导培养基（组分g/L）：酵母膏10，蛋白胨 20，葡萄糖 10。 YPDM 培养基：体积分数0.5%~3.0%甲醇；固体培养基在YPD 培养基中加入质量分数1.5%琼脂粉。

1.4 实验方法

1.4.1 菌种的活化及培养方法 菌种活化步骤是将菌株涂布在含有Zeocin 的YPD 固体培养基上活化，在30 ℃条件生长24~36 h，将平板上的单菌落平板划线或者在试管中斜面划线，在30 ℃生长24~36 h 后在4 ℃冰箱保存。

摇瓶培养：4 ℃冰箱中取出保存菌株接种于100 mL YPD 种子液培养基三角瓶中培养 （装液量25 mL），同时加入体积分数0.1% Zeocin，培养至一定浓度以体积分数1.0%转接于含有0.1%Zeocin 的YPDM 诱导培养基三角瓶，15 h 后用诱导剂甲醇进行诱导，甲醇诱导每24 小时补加一次，诱导前后每24 小时取样， 共培养 135~159 h。 摇瓶装液量为100 mL（500 mL 三角瓶）［13］，于 30 ℃转速 200 r/min摇床培养。

1.4.2 比色分析法测定菌体浓度 使用比色法测定菌体浓度， 以紫外分光光度计600 nm 波长处的光密度值 OD600表示［14］。 从斜面将接种体积分数1.0%毕赤酵母于25 mL YPD 培养基中摇瓶发酵培养，每隔2 小时取样，测量样品菌体浓度OD600值，直至数值趋于稳定为止。 共持续32 h，取样16 次，以OD600为纵坐标， 时间为横坐标作种子液培养基生长曲线。将OD600为15，摇瓶培养20 h 的种子液按接种体积分数1.0%接种于YPD 诱导培养基中，确定诱导培养基生长曲线。 每次试验都有一次重复试验，其中每批试验的各个梯度都做了3 个平行。

1.4.3 超氧阴离子自由基清除法测定酶活及不同表达条件目的蛋白质SDS-PAGE 分析 SOD 酶活测定：盐酸羟胺法测定［15］。 通过黄嘌呤氧化酶对黄嘌呤的催化作用， 可以产生超氧阴离子自由基，同时使盐酸羟胺氧化成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺的共同作用下表现紫红色。 采用紫外分光光度计测定了530 nm 处的吸光度。 当样品中含有抑制超氧阴离子自由基生成的组分时，样品中的亚硝酸盐含量降低。 最后测量吸光值时，样品的氧化活性越高其吸光值就越低。 因此，样品抗氧化活性可以用分光光度法测定。

样品酶活测定取离心发酵上清液（4 ℃、12 000 r/min，5 min）； 发酵液上清液的 SDS-PAGE 分析及目的蛋白质相对分子质量确定的具体步骤参照文献[15]。 采用SPSS 统计分析软件进行数据处理，每组重复3 次，3 次测定结果的平均标准偏差不大于±10%。实验结果做3 个平行，结果标准偏差±5%，否则不予使用。

1.4.4 目的蛋白质诱导表达测定 作者以Invitrogen 公司的毕赤酵母表达说明书为参考，先从平板上挑取重组菌株置于YPD 种子液培养基中，30 ℃振荡培养20 h 后， 按1.0%的接种体积分数转接至100 mL 的YPDM 诱导培养基中培养。 加入体积分数1.0%甲醇诱导，30 ℃摇瓶培养， 每隔24 小时取样并添加甲醇作为诱导剂， 在诱导4 d 后将发酵液收集， 进一步离心后取上清液做SDS-PAGE实验。

1.4.5 TAT-SOD 基因的荧光定量PCR 分析 采用UNIQ-10 柱Trizol 总RNA 提取试剂盒提取表达菌株总RNA, 使用第一链cDNA 合成试剂盒合成的cDNA 进行定量PCR 试验, 试验方法按照试剂盒说明书进行。 根据TAT-SOD 基因序列设计定量PCR的引物 SOD-F2 （5′-TCAACCCATTGTCCAGAAAG C-3′）和 SOD-R2（5′-GGTCACCAGACAAAGAGAT AACAGA-3′）。 定量 PCR 采用 ABI Stepone plus 型荧光定量 PCR 仪， 实验反应体系为：0.4 μL 的引物F2（10 mmol/L），0.4 μL 的引物 R2（10 mmol/L），10 μL 的 SYBR Green qPCR Master Mix （2X），2 μL模板 cDNA，，加无菌水至 20 μL。 定量 PCR 扩增程序按照标准程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s；60 ℃退火加延伸 30 s；45 个循环，其中融解曲线的程序温度为 65~95 ℃。 实验所用试剂为SybrGreen SG Fast qPCRMaster Mix 购自 BBI 公司，相对表达量计算采用 2－△△CT法。

2 结果与讨论

2.1 种子液的生长曲线

比色分析法测定菌体浓度从而制作生长曲线。从斜面将菌体接种于摇瓶培养后，每隔2 小时取样测量菌体浓度，结果见图1。 从图1 可知，种子液在摇瓶培养 18~22 h 之间， 即 OD600在 10~21 范围内时，菌体生长处于指数期且浓度较高，比较合适接种到诱导培养基中。

2.2 菌株在YPDM 诱导培养基的生长曲线

诱导时需要较强的菌体活力与一定菌体浓度，因此将 OD600为 15， 摇瓶培养 20 h 的 YPD 种子液按接种体积分数1%接种于YPDM 诱导培养基中，并每隔2 小时 取样，使用比色分析法测定菌体浓度得到生长曲线。 从图2 可以看出， 菌体在培养10~16 h 为指数期，为得到一定菌体浓度与较高菌体活力，在培养 12~16 h（OD600为 5~17 范围内）时诱导较为合适。

图1 种子液的生长曲线Fig. 1 Growth curve of seed broth

图2 菌株在YPDM 培养基的生长曲线Fig. 2 Strains growth curve in YPDM medium

2.3 诱导剂体积分数对目的蛋白质表达水平的影响

在30 ℃摇床培养15 h 后， 每天加入不同体积分数的甲醇进行诱导。 诱导剂体积分数分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%。诱导开始及随后的每24 小时取样，测定样品菌体浓度和酶活，并进行上清液SDS-PAGE 分析，结果见图 3。

图3 不同体积分数诱导剂的生长曲线、 酶活变化及SDS-PAGE 电泳图Fig. 3 Effect of different inducer concentration on cell growth, enzyme production and SDS-PAGE result

从图 3（a）和图 3（b）可看出，当诱导剂体积分数为1.0%时，样品的菌体浓度达到最高，酶活达到最高。经 SPSS 软件分析，图3（a）各梯度浓度菌体生长 159 h 时 F 值为 178.90，图 3（b）各梯度浓度酶活159 h 时 F 值为 885.98，查表得 F0.01（3，4）=16.69，各组显著差异（P<0.05）。由此可见，诱导剂甲醇体积分数对菌体浓度和SOD 酶活的影响显著。诱导剂的每天补加量大于体积分数1.0%时，前期菌体生长和蛋白质表达差异不明显，但后期酵母可能因甲醇中毒导致生长和表达蛋白质受到抑制；每天补加量少于体积分数1.0%时菌体生长较慢， 酶活也提高缓慢。因为毕赤酵母以诱导剂甲醇为其惟一碳源时，若甲醇体积分数过低将限制菌体生长。 从图3（b）可看出，每天补加体积分数1.0%甲醇在诱导111 h 后增加不明显。 图 3（c）的 SDS-PAGE 结果也可以看出，试验中诱导剂体积分数为1.0%时最佳，体积分数过低限制菌体生长，影响目的蛋白质的表达；在此体积分数以上目标蛋白质的表达逐渐下降，可能是由于毕赤酵母以甲醇为惟一碳源。 其代谢产物甲醛和过氧化氢的积累对毕赤酵母有毒害作用［16］，因此后续实验的诱导时间定为111 h， 每日加入体积分数1.0%甲醇进行诱导。

2.4 发酵初始pH 值对目的蛋白质表达水平的影响

为了调整YPDM 诱导培养基的pH 值， 使用柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液将初始pH 值分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。 将酵母于 30 ℃摇床培养，在15 h 后用体积分数1.0%甲醇持续进行诱导159 h，诱导前和诱导后每 24 小时取样测定样品， 培养基pH 变化见表1，最终菌体浓度、酶活和SDS-PAGE电泳图见图4。

表1 不同 pH 值培养基在培养前后 pH 值的变化Table 1 The change of pH value in different pH medium before and after fermentation

图4 不同初始pH 值的生长曲线、酶活变化及SDS-PAGE电泳图Fig. 4 Effect of different initial pH value on cell growth,enzyme production and SDS-PAGE result

由表1 可知， 使用缓冲溶液可以将pH 值稳定在一定范围，说明实验结果有一定参考价值。 各梯度初始 pH 值得到159 h 酶活数据经 SPSS 软件分析得 F 值为 946.64，查表 F0.01（4，5）=11.39，各组差异显著（P<0.05）。 这表示不同初始pH 值对菌株酶活、目的蛋白质表达水平有较大影响。比较图4（b）中各梯度初始pH 所对应表达酶活，在初始pH 值为5.0以下时酶活很低，pH 值为 7.0 时酶活最高。 从图4（a） 可以看出，初始 pH 值小于 5.0 时菌株可以生长但比较缓慢，在pH 6.0～8.0 时生长较快，说明该菌株有较强的pH 适应性。 图4（c）也说明目的蛋白质表达受不同初始pH 影响明显，随着pH 值的升高，电泳目的条带也逐渐增粗，pH 值达到6.0～8.0 后，继续提高pH 值对目的蛋白质表达水平影响不大，初始pH 值达到7.0 后蛋白质表达较好。 综上可知，相比于菌体生长情况， 不同初始pH 范围对酶活和蛋白质表达有较大影响，因此以7.0 为最佳初始pH 值。

2.5 诱导温度对目的蛋白质表达水平的影响

毕赤酵母通常在 30 ℃时利于外源蛋白质表达，当温度高于 32 ℃时，酵母的外源蛋白质表达受到较大影响。 在上述优化条件基础上确定诱导温度，分别选取在 28、30、32 ℃共3 个温度培养菌株，并使用体积分数1%甲醇诱导111 h，测定最终菌体浓度（OD600）和酶活，结果见图 5（a）和图 5（b），培养上清液蛋白质电泳图见5（c）。

SPSS 软件结果显示，F =157.65，F0.01（2，3）=30.82，各组间差异有显着性（P<0.05），表明温度对目标蛋白质的表达有显著影响。 当诱导温度为30 ℃时，酶活性和目标蛋白质表达水平最高。

从图5（a）可以看出，在试验的 3 个温度下，随着温度的升高，菌体生长加快，在 30 ℃和 32 ℃得到较高的菌体浓度，在30 ℃菌体生长最好。 从图5（b）可以看出，在 30 ℃时，测得的酶活最高，在 32 ℃时酶活降低较多。 图5（c）电泳结果说明，30 ℃时菌体外源蛋白质表达最大。 虽然毕赤酵母在 28～32 ℃时菌体均迅速生长，但低的诱导温度使菌体浓度和表达外源蛋白质不足，高温下外源蛋白质表达受到抑制。 所以选取30 ℃作为TAT-SOD 表达菌株的生长温度和最佳诱导表达温度。

2.6 目的蛋白质诱导表达最终优化条件测定

TAT-SOD 酵母菌株X33 摇瓶试验得到菌体浓度和SOD 酶活见图6（a），上清液菌体样品SDS-PAGE见图 6（b）。 确定发酵条件为：经过 20 h 摇瓶培养OD600为15 的YPD 种子液按接种体积分数1.0%接种到YPDM 诱导培养基中，在优化摇瓶发酵条件下（培养15 h 时诱导，诱导剂体积分数1.0%，诱导温度 30 ℃，初始 pH 值为 7.0），诱导 159 h 后收样，发酵液上清液酶活水平为753 U/mL， 较初始提高5.1倍。

图5 不同诱导温度的生长曲线、 酶活变化及SDS-PAGE电泳图Fig. 5 Effect of different inducing temperature on cell growth, enzyme production and SDS -PAGE result

图6 摇瓶发酵酶活、 菌体生长曲线和样品SDS-PAGE 电泳图Fig. 6 The enzyme production, cell growth and SDSPAGE result of induced expression in shake flask fermentation

从图6（a）可以看出，菌体生长随着酶活分泌同步增加。在111 h 之后菌体生长与酶活变化不大，最终诱导159 h 摇瓶上清液酶活为753 U/mL。 从图6（b）的电泳图也可以清晰看到，电泳条带随诱导时间逐渐变粗，在诱导87 h 后电泳条带不变，目的蛋白质表达提高不明显。 因此该菌株最佳摇瓶诱导时间为111 h，可以避免发酵后期染菌的风险。

2.7 pH 值对TAT-SOD 基因的转录水平的影响分析

诱导培养基发酵培养酵母，研究随着不同初始pH 变化TAT-SOD 基因的表达规律。荧光定量PCR选择内参基因actin 对目的基因相对定量的分析结果， 并 3 次重复实验得到 2－△△CT值进行单因素方差分析。 定量PCR 结果显示，在不同 pH 值培养下菌株中TAT-SOD 基因的诱导表达情况不相同。从图7可知，以菌株在pH 4.0 时的样品作为对照组，pH 在5.0 时表达mRNA 与对照组的差别不显著。 而pH为 6.0、7.0、8.0 时表达 mRNA 分别是对照组的2.4 倍、3.5 倍和 3.1 倍， 各组跟对照组有显著差异（P<0.05），经 SPSS 软件分析得 F 值为 657.32，查表 F0.01（4，5）=11.39。 并认为有显著的组间差异，这说明不同pH 环境对菌株的基因转录表达水平有显著影响。

图7 菌株在不同 pH 值培养下TAT-SOD 基因的相对表达量Fig. 7 Relative expression levels of TAT-SOD in Pichia pastoris grown at different initial pH value

图7 可以看出，X33 菌株在不同 pH 条件下，TAT-SOD 基因随着pH 值的升高均有一定倍数的上调表达。 其中在pH 7 时上调表达的倍数最高，是对照组 pH 4.0 上调倍数的 3.5 倍。 在 pH 8 下，基因的表达量比pH 7 时略低。在对照组pH 4.0 中，TATSOD 基因的表达量要比其它组显著变低。 而不同初始pH 条件下基因表达趋势与最终得到的酶活趋势基本相符合。 这表明除了菌体生长浓度影响目的蛋白质在发酵液中的表达水平， 不同pH 下基因转录水平差异也较大地影响了菌株的TAT-SOD 的表达程度。

3 结 语

作者采用经低温长时间保存的毕赤酵母表达菌株， 使含有TAT-SOD 基因的菌株在优化摇瓶发酵条件下成功地胞外分泌表达TAT-SOD。分泌出目的蛋白质可以改善大分子蛋白质SOD 细胞膜通透性[17]，实现将外源SOD 输送进入细胞内部协助相应的生命活动，清除胞内外自由基，增加超氧化物歧化酶SOD 在临床上的使用范围。 可能是诱导表达TAT-SOD 可提高毕赤酵母的抗衰老能力，长期低温保存的毕赤酵母在保藏过程中没有出现退化现象，仍可保持较强的目的蛋白质表达能力。

毕赤酵母表达外源蛋白质的主要发酵条件包括诱导时间、甲醇体积分数、pH 值、培养温度等因素。优化摇瓶发酵条件，诱导剂体积分数1.0%，诱导温度 30 ℃，YPDM 培养基， 初始 pH 值为 7.0 条件下，发酵上清液酶活水平为753 U/mL，未优化酶活水平为148 U/mL， 较未优化初始酶活提高5.1 倍；初始pH 值为7.0 时表达水平提高3.4 倍；后期经过5 L 发酵罐发酵， 最终得到TAT-SOD 酶活达到14 934 U/mL，是摇瓶水平的19.8 倍，说明长期保藏的重组菌株仍适合表达。 荧光定量PCR 试验表明，在转录水平差异上， 不同pH 条件下目的蛋白质表达水平受到基因转录水平和菌体生长的双重影响，而且前者的影响强于后者。

研究发酵条件是提高外源蛋白质在毕赤酵母表达水平的重要手段。 从本研究数据来看，TATSOD 的毕赤酵母表达菌株，经长时间保存后仍可保持较强的活力； 而且诱导初始pH 值对目的蛋白质的影响显著。 这些结果为该菌株的工业生产提供更多数据，有助于降低生产成本，更大程度上获得目的蛋白质。