蒙古族传统奶嚼口的微生物组成分析

徐伟良 ， 李春冬 ， 郭 梁 *，3， 郭元晟 ，3， 朱建军 ，郝苗苗 ， 钱俊平 ，3， 雅 梅 ，3

（1. 锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000；2. 锡林郭勒生物工程研究院，内蒙古 锡林浩特 026000；3. 锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心，内蒙古 锡林浩特026000）

蒙古族传统乳制品具有悠久的制作历史，其种类多样，味道鲜美，拥有独特的风味口感，含有丰富的蛋白质、脂肪及多种维生素，是提供营养物质的良好食品，在蒙古族的传统饮食结构中具有重要地位[1-2]。 蒙古族传统奶嚼口是将新鲜牛奶放置在阴凉避光处，使其自然低温发酵，发酵后上浮的乳白色稠油状物质即为奶嚼口。 蒙古族传统奶嚼口是一种高油脂类乳制品，根据刘文丽对蒙古族传统奶嚼口的理化性质和营养成分研究报道可知，其固形物平均质量分数可达到91.25%；平均蛋白质质量分数为1.82%； 平均总糖质量分数为54.45 mg/g； 平均pH值为3.765。 然而目前对蒙古族传统奶嚼口微生物多样性的研究还未见报道。

作者对锡林郭勒盟地区采集的蒙古族奶嚼口样品中乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌进行活菌分离计数，通过脂肪和酸度的检测指标来分析其对奶嚼口样品中菌群结构变化的影响。 利用分子生物学方法对乳酸菌进行鉴定，为潜在功能益生菌的开发提供了丰富的菌种资源，并对其地方标准制定以及工业化产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 试验所用14 份蒙古族传统奶嚼口样品均采于内蒙古锡林郭勒盟地区牧民家中，稀奶油样品是将牧民家中蒙古族传统奶嚼口发酵的前体原乳离心后所得。

1.1.2 培养基 菌种的鉴定使用乳酸细菌培养基（MRS）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基（LST）、煌绿乳糖胆盐培养基（BGLB）、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA）。

1.1.3 主要试剂与仪器 Takara 快速提取试剂盒（Code No.9164）： 购于大连宝生物工程公司；EasyTaq®PCR Super Mix（Lot#K20614）：购于北京全式金生物技术有限公司； 引物27F 和1495R：北京睿博生物科技有限公司合成；SW-J-2FD 净化工作台： 购于苏州博莱尔净化设备有限公司；HWS-250BX 恒温恒湿培养箱：购于天津市泰斯特仪器有限公司；2720 Thermal Cycler PCR 扩增仪： 购于BIORAB 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 奶嚼口样品采集 将在牧民家采集的传统奶嚼口搅拌均匀，将其装入无菌采样袋中，并编号和记录。 将所有样品放入便携低温恒温冰箱中暂时储存，尽快将样品送回实验室并进行菌种分离和理化检测。

1.2.2 样品脂肪和酸度测定 脂肪的测定参照GB 5009.6-2016[4]；酸度的测定参照 GB 5009.239—2016[5]。

1.2.3 样品中微生物活菌计数 乳酸菌计数参照GB 4789.35-2016[6]；大肠杆菌计数参照GB 4789.3—2016[7]；双歧杆菌计数参照 GB 4789.34—2016[8]。

1.2.4 样品中菌种的鉴定

1） 菌种DNA 提取 传统奶嚼口的基因组总DNA 的提取采用Takara 快速提取试剂盒。取30 μL裂解液于灭菌的Eppendorf（EP）管中，灭菌枪头过火后，冷却后的枪头挑取单菌落，置于EP 管液面以下，使菌落完全接触溶液并充分搅拌。 将EP 管置于金属浴上，80 ℃热变性 15 min，8 000 r/min 离心 5 min，将上清液吸出，转移至新EP 管中，所得菌液总DNA 作为后续PCR 反应的模板。

2） 菌种PCR 扩增及序列鉴定 乳酸菌选用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′） 用于扩增。PCR 反应体系： 模板 DNA 1 μL、 引物 27F 和引物1495R 各 1 μL、EasyTaq PCR Super Mix 10 μL、ddH2O 7 μL。

反应设定程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、58 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 2 min，共 30 循环；72 ℃末端延伸10 min。

扩增产物用1.2 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测合格的扩增产物送至北京睿博生物科技有限公司进行测序，测序结果经拼接后在美国国立生物技术信息中心 （national center for biotechnology information，NCBI）进行 BLAST 同源比对。

2 结果与讨论

2.1 奶嚼口的微生物活菌计数

采集于锡林郭勒盟地区的蒙古族传统奶嚼口样品中乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌活菌计数结果见表1。

乳制品的活菌数可以指示出样品的新鲜程度，并且高浓度的乳酸菌和双歧杆菌是发挥传统奶嚼口功效和筛选益生菌的必要条件。 从表1 可知，锡林郭勒盟地区14 份奶嚼口样品中乳酸菌活菌数在（7.91~8.69） lg（CFU/mL）之间，双歧杆菌活菌数在（4.09~6.64） lg（CFU/mL）之间，由于 14 份奶嚼口样品均采自锡林郭勒盟地区，牧区气候和地理环境相差不大， 因此测得14 份样品间乳酸菌活菌数和双歧杆菌活菌数相差不大。 其中所测样品的乳酸菌数与陈红霞等从鄂尔多斯地区传统乳制品中测得的乳酸菌数（6.26~9.99） lg（CFU/mL）[9]和德亮亮等从包头和巴彦淖尔地区传统乳制品中测得的乳酸菌数（6.74~9.16） lg（CFU/mL）[10]以及 Watanabe 等人从蒙古国地区以奶牛、牦牛、母马、山羊等为乳源的传统乳制品中测得的乳酸菌数（3.41~9.03） lg（CFU/mL）[11]相比，均在平均水平范围。 所测双歧杆菌活菌数与Delcenserie 等人在羊奶酪中分离的双歧杆菌活菌数（1.6~5） lg（CFU/g）[12]相比，高于上述数据。 因此可知，所测奶嚼口样品的新鲜程度较好，并含有丰富的乳酸菌和双歧杆菌， 有利于后续菌种的分离鉴定研究。

表1 传统奶嚼口样品中菌落计数结果Table 1 Colony counts of traditional Jiaokou samples

大肠杆菌作为乳制品的卫生指标菌，可以间接显示乳制品的卫生状况，大肠杆菌总数超标会对人体造成严重的危害。 由表1 可以看出，测得样品中大肠杆菌活菌平均数为2.63 lg（CFU/mL），个别样品中大肠杆菌总数较高。 大肠杆菌的出现可能和牲畜驯养环境、原料的采集、传统奶嚼口的加工条件、气候等因素有关。 自然发酵的传统奶嚼口保存了其中所含有益微生物，但是也含有对人体健康有潜在威胁性的微生物，因此需要对传统奶嚼口的微生物组成和乳酸菌菌群结构进行深入研究。

2.2 奶嚼口样品酸度与菌群之间的关系

从图 1 可看出， 乳酸菌在酸度 80.6~307 °T 区间活菌数稳定，强酸条件对乳酸菌的生长几乎没有影响，说明乳酸菌对强酸环境有耐受性，这与刘亚东等人研究结果相类似[13]。 双歧杆菌在酸度80.6~134 °T 区间时趋于稳定，说明酸度在小于 134 °T 时对双歧杆菌活菌数几乎没有影响，这与孟祥晨等对双歧杆菌生理功能特性的研究结果相类似[14]。 大肠杆菌活菌数随着酸度的升高而减少， 直至酸度到134 °T 时大肠杆菌已经减少至零，说明大肠杆菌可能对高酸度环境耐受性差， 这与Malgorzata 等人对双歧杆菌发酵乳活性的研究相类似[15]。

图1 奶嚼口样品中酸度和微生物活菌数之间的关系Fig. 1 Relationship between the acidity and the number of viable microorganisms in traditional Jiaokou

2.3 稀奶油中微生物活菌计数

蒙古族传统奶嚼口是生牛乳自然发酵后乳脂上浮的产物，通过表1 可知其平均脂肪质量分数达35.3%。 蒙古族传统奶嚼口作为一种高油脂类乳制品，类似于商用生产中通过离心的方法将原牛乳中的乳脂分离出来制成的稀奶油产品[16-17]。 稀奶油是原牛乳未经发酵而制成的乳脂产品，相当于蒙古族传统奶嚼口发酵的前体，因此，作者也对稀奶油中微生物菌群组成进行研究，以期发掘稀奶油与蒙古族传统奶嚼口微生物菌群之间的相互关系以及对奶嚼口产品发酵的影响，并为奶嚼口商用产品的研发提供有益借鉴。

从表2 可以看出，稀奶油样品随着静置发酵时间的延长，乳酸菌数从5.63 lg（CFU/mL）增长至8.04 lg（CFU/mL）；双歧杆菌数从 3.08 lg（CFU/mL）增长至 5.45 lg（CFU/mL）；大肠杆菌数从 4.74 lg（CFU/mL）增长至6.68 lg（CFU/mL）。 稀奶油样品中乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌活菌数均呈上升趋势，并且菌群数量与奶嚼口样品中的菌群数量相近，从而可推测稀奶油样品和奶嚼口样品中含有相似的菌群结构。同时随着静置发酵时间的延长，稀奶油样品的酸度逐渐上升，脂肪含量呈下降趋势，这说明乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌在稀奶油中大量繁殖并对稀奶油进行发酵。

表2 稀奶油样品菌落数与理化指标Table 2 Colony counts and physicochemical profiles of cream samples

2.4 奶嚼口样品中菌种鉴定结果

将传统奶嚼口通过微生物培养方法，分别接到不同培养基进行培养，按照菌落的颜色、大小、边缘是否整齐、表面是否光滑等特征挑选，在14 份样品中共挑选出55 株菌株。 将挑取的菌株进行DNA 提取和PCR 扩增，并将扩增产物送测序公司进行测序分析。 测序后的基因序列与NCBI 数据库中已知序列进行同源性比较，结果见图2。 分离的55 株菌株分属于 5 个属： 肠球菌属 （Enterococcus faecalis 34.55%、Enterococcus faecium 1.82%）， 乳杆菌属（Lactobacillus plantarum 25.45% 、Lactobacillus paracasei 9.09%、Lactobacillus helveticus 1.82%），乳球菌属 （Lactococcus lactis 16.36%）， 双歧杆菌属（Bifidobacterium crudilactis 5.45% 、Bifidobacterium psychraerophilum 3.64%） 及链球菌属（Streptococcus thermophilus 1.82%）。

图2 奶嚼口菌种序列鉴定结果Fig. 2 Sequencing results of strains in traditional Jiaokou

肠球菌属是人和动物肠道的正常菌群，通常被当做益生菌， 有着良好的生物安全性和益生特性。Nuenopalop 等在人的粪便中分离出的E. faecalis 具有良好胃酶和低pH 耐受性，并且对万古霉素、利福平、四环素和红霉素敏感，对四环素氯霉素和卡那霉素具有耐药性[18]。 Haghshenas 等人在150 种传统乳制品中分离出的E. faecium 不仅对低pH 环境有较强的抵抗力，还能在肠道壁上粘附增值并且还能有效的排斥病原菌的定植，从而达到抑制病原菌的效果[19]。 晏涛研究发现，E. faecium HDRsEf1 可以帮助维持和增强肠道的屏障功能， 减轻感染ETEC 的小鼠肠道炎症以及小鼠体重降低和腹泻症状[20]。

乳杆菌属是由一类遗传和生理特性多样的杆状乳酸菌构成，到目前为止乳杆菌属是乳酸菌中最大的一个属。 基于发酵的最终产物，这个属的种可以被划分为3 组，即同型乳酸发酵的乳杆菌、兼性异型乳酸发酵的乳杆菌和专性异型乳酸发酵的乳杆菌。 郭怡麟选取经过益生评价的L. plantarum ZDY2013 对Helicobacter pylori 进行拮抗抑制试验，发现其选取的 L. plantarum 可以有效拮抗Helicobacter pylori SS1 粘附在人胃腺癌细胞上[21]。张丹丹等人对实验室保藏的一株L. plantarum 进行研究发现，此株L. helveticus 具有一定的耐酸及耐胆盐能力，并且对Caco-2 细胞具有较强的黏附能力[22]。

乳球菌属是一类革兰氏阳性菌，部分菌种可从乳制品、植物产品等分出，其模式种为乳酸乳球菌。乳酸乳球菌是发酵工业中常用的的发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中。 徐海燕等人在中国的内蒙古牧区、西部少数民族地区和蒙古国发酵乳中分离出了204 株L. lactis[23]。 张燕在酸马奶中分离L. lactis代谢产物对小鼠盲肠微生物以及营养代谢的影响，发现L. lactis 可减少小鼠盲肠中的大肠杆菌数量，增加 Lactobacillus 和 Bifidobacterium 数量[24]。

链球菌属广泛分布于自然界， 从水、 乳、尘埃、人和动物粪便皆可检出。 常见的对人体有益的链球菌为嗜热链球菌，是制作酸奶的必需菌种。 华鹤良等人对乳品厂保藏的乳酸菌样品进行分子鉴定，最终分离出了一株综合发酵性能良好的S. thermophilus[25]。 Sun 等人在青海省传统发酵牦牛乳制品中分离出嗜热链球菌，通过发酵产物进行试验， 最终成功筛选出具有优良发酵特性的S.thermophilus ND03[26]。王玥研究发现，S. thermophilus有缓解细胞氧化应激作用[27]。

双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一， 广泛存在于人和动物的消化道、口腔等生境中。 一些双歧杆菌的菌株可以作为益生菌用在食品、医药和饲料方面。 Bunesova 等人对羊奶酪中双歧杆菌进行分离鉴定， 第一次证明了B. crudilactis 存在于绵羊奶酪中[28]。 Hsieh 等人对开菲尔粒中微生物进行分离鉴定，其中分离出了B. psychraerophilum[3]。

3 结 语

作者对锡林郭勒盟地区采集的14 份蒙古族传统奶嚼口样品进行了微生物组成分析，其中乳酸菌活菌数在（7.91~8.69） lg（CFU/mL），双歧杆菌活菌数在（4.09~6.64） lg（CFU/mL），大肠杆菌活菌数在（0~5.45） lg（CFU/mL）。 对奶嚼口样品进行菌种鉴定分析表明，奶嚼口样品中菌种分属于5 个属，其中优势菌株为粪肠球菌 （Enterococcus faecalis 34.55%）、 植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum 25.45%）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis 16.36%）。

奶嚼口样品的酸度和微生物活菌数之间的关系研究表明，乳酸菌对高酸度环境耐受性强，当酸度条件达307 °T 任对乳酸菌的生长几乎没有影响；双歧杆菌在酸度80.6~134 °T 区间时趋于稳定；大肠杆菌活菌数随着酸度的升高而减少，直至酸度到134 °T 时大肠杆菌已减少至零，说明大肠杆菌可能对高酸度环境耐受性较差。 通过对稀奶油样品中乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌分析表明，其菌群数量与奶嚼口样品中的菌群数量相近，从而可推测稀奶油样品和奶嚼口样品中含有相似的菌群结构。 上述研究表明，蒙古族传统奶嚼口具有丰富的益生菌资源，在微生物资源开发和商业化生产方面具有巨大潜力。