两步法催化鱼油制备MLM型结构三酰甘油酯

钟 晨 何勇锦,2 Zheng Guo 陈必链,2

(福建师范大学生命科学学院1，福州 350117)(福建师范大学;工业微生物教育部工程研究中心2，福州 350117)(Department of Engineerin, Aarhus University3，Aarhus 8000 Denmark)

结构三酰甘油酯是一类特殊的油脂，即通过化学方法或酶催化方法将目的脂肪酸嵌入到甘油骨架的特定位置。已有大量临床实验表明，食用结构三酰甘油酯可提高机体免疫力、抑制血栓形成、预防肥胖等[1-3]。目前，科技工作者已将短链(C2～C6)、中链(C8～C12)和长链(≥C14)脂肪酸嵌入到甘油结构的特定位置上，旨在制备具有特殊理化性质的结构三酰甘油酯。其中，中链脂肪酸位于甘油结构的sn-1与sn-3位置上和长链饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸位于sn-2位置上的结构三酰甘油酯(MLM型结构三酰甘油酯)，已受到消费者的青睐[4]。食用这类结构酯，经机体胰酶水解后，肠道细胞所吸收中链脂肪酸运输到肝脏进行β-氧化代谢提供能量；2-单酰甘油酯的脂肪酸经乳糜作用重新形成三酰甘油和/或合成磷脂，进一步组装吸收构成细胞膜和/或生物膜的结构[4]。因此，开发MLM型结构三酰甘油酯是改性油脂的热门方向之一。

与化学法相比，采用脂肪酶催化制备MLM型结构三酰甘油酯，具有如下优点：反应条件温和、酶具有底物特异性、避免催化底物的氧化。当前，脂肪酶催化制备MLM型结构三酰甘油酯的方法有一步酶催化法和两步酶催化法[5，6]。一步酶催化法是指利用sn-1,3选择性的脂肪酶催化三酰甘油酯和中链脂肪酸或其乙酯，使甘油骨架上的sn-1,3脂肪酸被替换成中链脂肪酸，最终生成MLM结构三酰甘油酯[7]。由于该方法制备的MLM结构三酰甘油酯纯度不高和嵌合率低(<50%)，影响该方法的推广。为了解决这个问题，研究者开发了两步酶催化法，即先通过sn-1,3选择性的脂肪酶醇解反应生成2-单酰甘油酯，再利用脂肪酶催化2-单酰甘油酯与中链脂肪酸发生酯化反应形成MLM结构三酰甘油酯。

鱼油是消费者摄取多不饱和脂肪酸的主要来源[8]。食用多不饱和脂肪酸(如亚油酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))可以治疗和/或预防癌症、中风、痛风、炎症等疾病，降低机体血液的胆固醇和血脂浓度，提高机体免疫力，促进脑细胞、神经细胞等组织和器官的生长和发育等。因此，利用鱼油为底物开发结构三酰甘油酯具有重要意义。Robles课题组[9]选择Novozym 435作为催化剂，通过两步酶催化法催化鳕鱼肝油制备MLM结构型三酰甘油酯。Irimescu等[10]首先利用Novozym 435醇解催化鲣鱼鱼油获得2-单酰甘油酯，随后再利用Lipozyme RM IM催化2-单酰甘油酯与辛酸(CA)乙酯制备MLM结构三酰甘油酯。与Novozym 435和Lipozyme RM IM相比，Lipozyme TL IM是一种价格更低廉的sn-1,3选择性脂肪酶[11-13]。基于此，利用Lipozyme TL IM作为生物催化剂开发MLM结构型三酰甘油酯，可以大大降低工艺成本。但是，关于Lipozyme TL IM催化鱼油制备MLM结构三酰甘油酯的报道甚少。因此，本研究选择Lipozyme TL IM作为生物催化剂，通过两步酶催化法(醇解反应和酯化反应)催化鱼油制备MLM结构型三酰甘油酯(M=CA)。研究工艺参数(如含水量、催化温度等条件)对Lipozyme TL IM催化性能的影响。同时，利用核磁共振仪、气相色谱仪和差示扫描热量法(Differential scanning calorimetry，DSC)分析产物的脂肪酸组成及其位置分布、结晶点和熔点，为MLM结构型三酰甘油酯的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鳀鱼鱼油、固定化Lipozyme TL IM。

1.2 主要仪器与设备

ZNCL-BS智能磁力搅拌器,MK-6s薄层色谱-火焰离子化检测器,SCION 436-GC气相色谱仪,Pyris 6差示扫描量热仪。

1.3 方法

1.3.1 优化Lipozyme TL IM两步酶催化法制备MLM结构三酰甘油酯的工艺条件

第一步醇解催化反应：在室温条件下，醇解催化体系组成为0.5 g鳀鱼鱼油、无水乙醇、蒸馏水和10%固定化酶Lipozyme TLIM(基于鱼油质量)组成的。研究水含量和乙醇与底物的摩尔比对Lipozyme TL IM催化鱼油生成2-单酰甘油产量的影响，获得制备2-单酰甘油的优化条件。为了获得足够的2-单酰甘油酯，通过小型搅拌式反应器进行放大实验，制备2-单酰甘油酯。

第二步酯化催化反应：利用Lipozyme TL IM催化2-单酰甘油酯与辛酸(C8∶0)制备CA-L-CA结构三酰甘油酯，以0.1 g的2-单酰甘油酯为底物，研究温度、单酰甘油酯与辛酸的摩尔比和催化时间对结构三酰甘油酯产量的影响，获得催化制备MLM结构三酰甘油酯的最适工艺条件。

1.3.2 Lipozyme TL IM的可再利用性

为了降低工艺成本，Lipozyme TL IM的可再生利用性进行评估。在最优条件下，通过离心(5 000r/min，5min)收集反应后(醇解反应和酯化反应)的酶试剂。用无水乙醇：正己烷(1∶1)洗涤酶试剂三次，随后置于抽真空装置中处理24 h，去除有机溶剂。将收集的Lipozyme TL IM再次进行两步酶催化反应，以2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯产量为指标，评估Lipozyme TL IM的可再利用次数。

1.4 参数测定

利用Luddy等[14]和Wang等[15]的方法，测得鳀鱼鱼油的sn-2位置脂肪酸组成。利用薄层色谱法-火焰离子检测器(TLC-FID)分析技术[16]，对含脂肪酸乙酯(FAEEs)，三酰甘油酯(TAGs)，游离脂肪酸(FFA)，二酰甘油酯(DAGs)和单酰甘油酯(MAGs)的样品进行定量定性分析。油脂样品通过甲酯化后，通过气相色谱仪(Trace GC Ultra，Thermo Scitific)测定脂肪酸的组成，使用SLB-IL-111色谱柱(Supelco，直径为0.25 mm，厚度为0.2 μm)测定各脂肪酸[17]。采用核磁共振仪(Bruker Advance 400MHZ)分析鳀鱼鱼油和产物的油脂类型和脂肪酸组成[18,19]。利用Pyris 6 DSC仪器(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA)分析原油、2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯的结晶点和熔点[20]。利用差示扫描量热仪(Pyris 6 DSC)分析测得油脂样品的熔点和结晶点。

基于实验室的方法[17]，收集2-单酰甘油酯。酯化反应后，100 mg样品置于硅胶柱(直径10 mm，长度100 mm，硅胶粉颗粒大小，200～300目)上，用40 mL的正己烷∶乙醚(9∶1)溶剂洗脱柱子，收集MLM结构型三酰甘油酯。MLM结构三酰甘油酯的转化率可用如下公式进行计算:

MLM结构型三酰甘油酯的转化率(wt%)= MLM结构型三酰甘油酯的质量×100%/(2-单酰甘油酯质量+辛酸质量)

2 结果与讨论

2.1 鱼油的脂肪酸特性

从图1a可看出，鳀鱼鱼油的碳谱在69.52和69.31处有信号。已有研究表明，三酰甘油酯的甘油骨架碳谱信号分布于69.4左右[21]。这个结果可说明，鳀鱼鱼油底物是以三酰甘油酯形式存在的。采用气相色谱仪测得脂肪酸组成，结果见表1。鳀鱼鱼油的主要脂肪酸是棕榈酸(PA，17.8%)、油酸(OA，23.14%)、亚油酸(LA，8.24%)、EPA(8.08%)、DHA(9.76%)；鱼油的长链饱和脂肪酸(LSFAs)和多不饱和脂肪酸(PUFA)的质量分数分别为23.76%和36.31%。值得注意的是，DHA主要分布在鱼油的sn-2位上，其质量分数为20.88%。同时，采用13C-NMR技术分析鱼油脂肪酸位置分布情况，结果见图1b。DHA也主要分布在甘油骨架的sn-2位上。通过积分DHA峰值后，sn-2-DHA与sn-1(3)-DHA的摩尔比为2.15∶1，这个结果能气相色谱仪测定的结果sn-2-DHA和sn-1(3)-DHA的摩尔比为(20.88%÷311)：[(9.76%×3)÷311]≈2.48∶1吻合。在sn-2位上，鳀鱼鱼油的总饱和脂肪酸(SFAs)和PUFAs含量分别为23.76%和50.06%。因此，利用鳀鱼鱼油制备CA-SFAs-CA和CA-PUFAs-CA两种结构三酰甘油酯，有利于婴幼儿[22]和成年人[23]对营养元素的吸收。为了制备纯度高的CA-SFAs+PUFAs-CA结构三酰甘油酯，有必要评估和优化Lipozyme TL IM的两步酶催化的工艺条件。

表1 鳀鱼鱼油及其sn-2位和Lipozyme TL IM醇解反应制备2-单酰甘油酯的脂肪酸组成

注：MFAs为单不饱和脂肪酸，SDA为十八碳四烯酸。图1 鳀鱼鱼油的碳谱信号

2.2 优化 Lipozyme TL IM催化鱼油制备2-单酰甘油酯的工艺条件

研究含水量(0、1%、5%、9%和13%)对Lipozyme TL IM催化鱼油生成2-单酰甘油酯产量的影响，结果见图2a。当含水量为5%或9%，Lipozyme TL IM催化鱼油生成的2-单酰甘油酯含量高于其他组的结果。因此，Lipozyme TL IM催化三酰甘油制备2-单酰甘油酯最适含水量为5%～9%。

图2 不同因素对Lipozyme TL IM催化鱼油生成2-单酰甘油酯产量的影响

在含水量为5%条件下，进一步研究不同乙醇与鱼油的摩尔比对Lipozyme TL IM催化鱼油生成2-单酰甘油酯产量的影响，结果见图2b。乙醇与底物的摩尔比从2∶1增加32∶1时，Lipozyme TL IM催化鱼油生成的2-单酰甘油酯产量逐渐增加(从1.43%上升到32.49%)。当乙醇与底物的摩尔比继续增加到64∶1时，Lipozyme TL IM催化底物生成的2-单酰甘油酯产量，无显著差异。因此，为了降低工艺成本，选择32∶1为Lipozyme TL IM催化油脂生成2-单酰甘油酯的最适合乙醇与油脂的最佳摩尔比。

2.3 小规模放大制备2-单酰甘油酯

为了降低酶试剂的使用量，在进行小规模放大实验时，选择5%的Lipzoyme TL IM酶载量，制备2-单酰甘油酯。由图3a可得，随着反应时间的延长(0～12 h)，底物三酰甘油酯含量逐渐下降，二酰甘油酯的含量先上升后下降的趋势，2-单酰甘油酯(35%左右)和脂肪酸乙酯(60%左右)质量分数先上升后趋于恒定值。当反应进行至8 h时，醇解反应体系中的各油脂类型的含量基本处于平衡状态，2-单酰甘油酯质量分数维持在35%左右。

在反应结束后，通过TLC板分离获得2-单酰甘油酯，利用GC-FID测定2-单酰甘油酯的脂肪酸组成，结果见表1。Lipozyme TL IM催化鱼油生成的2-单酰甘油酯的脂肪酸组成与原油的sn-2的脂肪酸组成(表1)无显著差异。同时，2-单酰甘油酯的脂肪酸组成能与13C-NMR测定结果(图3c)相一致。此外，图3b是通过13C-NMR技术分析2-单酰甘油酯的碳谱结果。由图3b可得Lipozyme TL IM催化鱼油所得的2-单酰甘油酯质量分数超过90%，即11.08×100%÷(11.08+1)≈91.72%。这些结果可进一步表明，Lipozyme TL IM是一种sn-1,3选择性的脂肪酶，在醇解反应过程中，该酶主要作用甘油骨架的sn-1和3位上的脂肪酸，从而形成2-单酰甘油酯产物。

注：醇解反应条件：30 g鱼油、醇油比为32∶1，Lipozyme TL IM酶载量为5%，反应温度为25 ℃。图3 小规模放大制备2-单酰甘油酯

2.4 优化Lipozyme TL IM催化2-单酰甘油酯与辛酸制备MLM结构三酰甘油酯的工艺参数

从表2结果可知，催化温度会影响Lipozme TL IM催化制备MLM结构三酰甘油酯产量。当温度为40 ℃时，Lipozyme TL IM催化制备MLM结构型三酰甘油酯的质量分数最高，达89.81%。根据Arrhenius定律，提高反应温度有利于产物的生成[24]。但当催化温度高于40 ℃时，Lipozyme TL IM催化制备结构三酰甘油酯质量分数低于90%。这结果不符合Arrhenius定律，可能是因为酶生物催化剂与化学催化剂的组成成分是不一样。过高的温度抑制酶的活性，从而影响酶的催化速率和结构三酰甘油酯产量。

表2 不同条件对Lipozyme TL IM催化2-单酰甘油酯与辛酸生成MLM结构型三酰甘油酯产量的影响

底物的摩尔比和催化时间也有影响Lipozyme TL IM催化制备MLM结构三酰甘油酯产量。当2-单酰甘油酯与辛酸的摩尔比从1∶2增加到1∶3时，MLM结构三酰甘油酯产量从77.06%提高到89.81%。当2-单酰甘油酯与辛酸的摩尔比继续提高到1∶4时，MLM结构三酰甘油酯产量为91.84%，与底物摩尔比为1∶3的结果相似。同时，当催化时间从12 h(实验号7)增加到24 h，MLM结构三酰甘油酯含量也随之增加(51.32%提高到89.81%)；当催化时间再延长至36 h时，MLM结构三酰甘油酯的含量已不再增加(88.28%)。因此，由表2可得，Lipozyme TL IM催化2-单酰甘油酯与辛酸制备MLM结构三酰甘油酯含量的最适催化条件为：以正己烷作为有机溶剂介质，催化温度为40 ℃，2-单酰甘油酯与辛酸的摩尔比为1∶3，催化时间为24 h。

表3 MLM结构三酰甘油酯及其sn-2位的脂肪酸组成/%

MLM结构型三酰甘油酯及其sn-2位的脂肪酸组成，结果见表3。MLM结构三酰甘油酯的CA、SFAs、EPA、DHA和PUFAs质量分数分别为62.47%、72.93%、3.02%、7.55%和16.52%。对于MLM结构三酰甘油酯的sn-2位脂肪酸组成，SFAs、EPA、DHA、n-3PUFAs和PUFAs质量分数分别为29.79%、9.09%、20.37%、35.22%和44.67%。基于表3结果可得，MLM结构三酰甘油酯的主要类型是CA-LSFAs-CA和CA-PUFAs-CA。在sn-2上，CA质量分数为7.52%；这个结果表明，在酯化反应过程中，Lipozyme TL IM有发生酰基转移的现象。以前的研究也发现，脂肪酶催化过程中会发生酰基转移的现象[25]。

在最优条件下，评估Lipozyme TL IM的可再利用性，降低工艺成本。通过评估发现，Lipozyme TL IM进行醇解反应和酯化反应制备MLM结构三酰甘油酯只能再利用3次。在进行第4次时，2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯质量分数显著下降到20.58%和75.48%。为了解决这个问题，今后的研究可开发更稳定的固定化载体，提高Lipozyme TL IM的可再利用次数。

本研究中，经优化后，Lipozyme TL IM催化鳀鱼鱼油制备2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯的质量分数分别约为35%和92%。这两个值接近于Roxana等[7]所报道的结果。但是，Roxana等选择较昂贵的Novozym 534(醇解反应，30.8%2-单酰甘油酯)和Lipzoyme RM IM(酯化反应，85.3%MLM结构三酰甘油酯)进行两步法制备MLM结构三酰甘油酯，大大增加了工艺成本[22]。因此，选择更低廉的Lipozyme TL IM作为催化剂，开发MLM结构三酰甘油酯具有更广阔的应用前景。

2.5 鱼油、2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯的结晶点和熔点

从图4可看出，鳀鱼鱼油的结晶温度范围分别约为-31.17～-5.17 ℃和-33.50～-5.60 ℃。鱼油的熔点温度范围约为-31.58～21.00 ℃，含有3个熔点峰，即-17.80、4.25、12.25 ℃。图4表明，Lipozyme TL IM催化鱼油分别生成的2-单酰甘油酯的熔点和结晶点曲线也有所差异。在图4a中，2-单酰甘油酯的结晶温度范围约为4.5～21.67 ℃，含有一个峰，即10.67 ℃。MLM结构三酰甘油酯的结晶温度范围分别为-18.50～38.50 ℃(2个响应峰，-25.17、-18.52 ℃)和-16.17～-36.33 ℃(2个响应峰，-22.14、-18.00 ℃)。这说明，改性鱼油后制备MLM结构三酰甘油酯的结晶温度略低于鱼油原油的结晶温度，也显著低于它们为底物催化生成2-单酰甘油酯的结晶温度。这是因为Lipozyme TL IM改性鱼油后，鱼油的sn-1,3的长链脂肪酸被替换成辛酸(脂肪酸碳链变短)，从而使MLM结构三酰甘油酯的结晶温度降低。此外，2-单酰甘油酯的结晶温度显著高于三酰甘油(原油和结构三酰甘油酯)的结晶温度。Cheong等[26]研究猪油单酰甘油酯、二酰甘油酯和三酰甘油酯的结晶和熔点变化，也报道过该结果，其原因是单酰甘油酯和三酰甘油酯的结构不同。因此，通过图4的结果，可为不同功能性油脂包括2-单酰甘油酯和MLM结构三酰甘油酯的具体应用范围提供实践依据。

图4 鱼油、2-单酰甘油酯和MLM结构型三酰甘油酯的结晶点和熔点

3 结论

本研究建立了一种以Lipozyme TL IM作为生物催化剂催化鳀鱼鱼油制备MLM结构三酰甘油酯的两步酶催化法。在醇解反应中，Lipozyme TL IM催化鱼油制备单酰甘油酯质量分数约为35%，其中2-单酰甘油酯质量分数占91.72%。在2-单酰甘油酯与辛酸的酯化反应中，Lipozyme TL IM制备MLM结构三酰甘油酯的最大转化率91.84%。MLM结构三酰甘油酯的主要类型是CA-SFAs-CA和CA-PUFAs-CA。基于这些结果可表明，Lipozyme TL IM催化鱼油开发婴幼儿CA-SFAs-CA产品和成年人CA-PUFAs-CA产品等高值化产品，为脂肪酶的应用提供参考。