二氧化碳膨胀乙醇提取香樟精油的工艺研究

王 芳 林洁茹 单姝婷 潘佳佳 王梦瑶 邓 刚

(浙江省特色经济植物生物技术研究重点实验室；浙江师范大学化学与生命科学学院1，金华 321004)(浙江师范大学行知学院理学院2，兰溪 321100)

香樟(Cinnamomumcamphora)，起源于中国南部、越南和日本等地[1]，是一种广泛分布于亚洲东部、大洋洲和太平洋诸岛的大型常绿乔木[2]。香樟在中国是重要的经济树种和城市绿化树种之一，种植面积已达5万多公顷[3]。按每年修枝率5%计算，仅一个中型城市修剪产生的枝叶可达3万t[4]，其中部分被废弃，但主要可用于精油的提取。从香樟枝叶中提取的精油富含萜类化合物，其中芳樟醇、桉叶油素、萜品醇等是精油的主要成分[5]，具有抗菌[6-8]、抗氧化[9]、杀虫[10]等生物活性，作为重要的生产生活资源，被广泛应用于医药、化工、食品、香精香料等行业。

目前，香樟精油最常用的提取方法为水蒸气蒸馏法，精油得率约1%～2%，但蒸馏时间长，提取温度高，系统开放，易造成活性成分损失[11]。不同于水蒸气提取的蒸馏原理，有机溶剂提取是根据各组分溶解性的差异，该法用于香樟精油的提取，得率可达4%[12]，但精油中含有非挥发性成分，且存在有机溶剂残留。随着人们对天然产品及食品安全性的日益关注，基于超临界流体的绿色提取技术已成为了研究热点。其中CO2作为最常用的提取剂，具有超临界条件温和、无残留、成本低等特点[13]，但由于超临界二氧化碳流体极性范围窄，溶解能力有限，主要适用于低极性的亲脂性活性成分的提取，因此，近年来出现了另一种新型的绿色溶剂二氧化碳膨胀乙醇(CO2-Expanded Ethanol, CXE)[14]。它是以乙醇为主体，加入少量压缩CO2，使其溶解在乙醇中，从而形成的流体。通过改变CO2和乙醇的比例，使得流体的极性范围更广，溶解能力更高，已被广泛用于热敏性及易氧化物质的提取[15]，本实验室也采用CXE完成了对微藻油脂[16]及香根草精油[17]的提取。本次研究将尝试采用CXE技术对香樟叶中的精油进行提取，通过测定精油的化学成分及抗氧化、抗菌活性，并与传统提取方法进行对比，从而评估新工艺的特点及可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

香樟鲜叶在2018年10月采摘于浙江省金华市(29°04′N，119°38′E，海拔70 m)，洗净后于室温下阴干24 h。干燥后的枝叶剪成碎片并用液氮研磨成粉末，-20 ℃密封保存。

抑菌活性测定的菌种包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, ATCC No. 29213)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis, ATCC No. 14579)、大肠杆菌(Escherichiacoli, ATCC No. 8739)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa, ATCC No. 27853)、黑曲霉(Aspergillusniger, ATCC No. 16888)和白色念珠菌(Candidaalbicans, ATCC No. 10231)，均由浙江师范大学菌种保藏中心保藏。

1.2 仪器与试剂

HELIX超临界天然产物萃取系统，K-501双活塞往复泵，7820A-5975C气相色谱-质谱联用仪，BSA224S电子天平，D-1自动控制压力蒸汽灭菌锅；SW-CJ-1FD洁净工作台；ZQZY-70BS振荡培养箱。

CO2气体(纯度≥99.9%)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)、过硫酸钾(K2S2O8)、二甲基亚砜(DMSO)、庆大霉素、两性霉素B；二氯甲烷、环己酮为色谱纯；乙醇等其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 香樟精油的提取方法

二氧化碳膨胀乙醇提取：称取50 g香樟叶粉末，与等体积玻璃珠混合均匀，置于萃取釜中。设定萃取釜的温度为40 ℃；压力为7 MPa，乙醇通过双活塞往复泵以5 mL/min的流速泵入，二氧化碳则由柱塞泵加压，流速为0.6 L/min，经混合器和乙醇混合形成CXE流体进入萃取釜内，对物料进行连续提取。每隔30 min由分离釜底部收集香樟叶精油乙醇混合液，在绝对压力0.01～0.05 MPa，温度45～55 ℃的条件下减压蒸发，去除乙醇后，得到香樟叶精油。

超临界二氧化碳提取：采用相同的装置。称取50 g香樟叶粉末，加入等体积玻璃珠，置于萃取釜中。分别设置萃取釜的温度为50 ℃，压力为25.5 MPa，二氧化碳流速为0.6 L/min，提取时长共90 min。

水蒸气蒸馏提取：将50 g的香樟叶粉末按照1∶4的料液比装入水蒸气蒸馏装置中，蒸馏提取2 h，停止加热后，待提取器静置分层，取上层油状物质，加入适量无水硫酸钠干燥，制备得到的精油保存在棕色玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱中储存。

有机溶剂提取：称取30 g香樟叶粉末，以乙醚为溶剂，采用索氏提取法，在55 ℃下抽提4 h。提取结束后，通过减压旋转蒸发除去乙醚，称重，试验重复3次。

1.3.2 香樟精油的组成及含量分析

采用GC-MS对4种提取方法所得的香樟精油进行成分分析。色谱条件：毛细管柱为HP-5 ms (30 m×0.25 mm×0.10 μm)；载气为高纯氦气(纯度>99.99%)，流速1 mL/min。样品用二氯甲烷进行稀释，体积分数为1%，进样量为1 μL，分流比1∶50。进样温度和检测温度分别设置为250、280 ℃。采用程序升温：初温50 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min；再以2 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min。质谱条件：电子能量为70 eV，扫描范围40～400 amu，扫描速率3.99 scans/s，溶剂延迟2 min。将挥发性物质的质谱和保留指数与质谱数据库(WILEY10, NIST2017)以及文献报道中的化合物和进行比较，从而对香樟精油的成分进行鉴定；以环己酮作为内标物，通过气相色谱对各组分进行了定量分析。

1.3.3 抗氧化实验

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

分别移取50 μL 20 mg/mL的乙醇精油溶液与50 μL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合均匀，避光反应30 min后，采用酶标仪在517 nm处测定吸光值AX, DPPH。DPPH自由基清除率计算如下：

式中：AX, DPPH为乙醇对照组。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力的测定

将7 mmol/L ABTS储备液和2.45 mmol/L K2S2O8储备液等体积混合均匀，在室温下避光静置12～16 h，得到ABTS自由基母液。用乙醇稀释母液，734 nm处测得吸光度值约为0.7±0.05，稀释后的溶液为ABTS工作液。分别移取50 μL 20 mg/mL的乙醇精油溶液与50 μL已配置好的ABTS工作液混合均匀，避光反应30 min后，采用酶标仪在734 nm处测定吸光值AX, ABTS。ABTS自由基清除率计算如下：

式中：A0, ABTS为乙醇对照组。

采用方差分析法，分别对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率结果进行显著性分析，当P<0.05时具有显著性差异。

1.3.4 抑菌活性测定

采用微量稀释法测定4种香樟精油对两种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和两种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)的最小抑菌浓度(MIC)。配制1%的DMSO精油样品溶液，开始时在96孔板第一行每孔中加分别加入50 μL的各精油样品和50 μL的MH肉汤培养基(Mueller Hinton broth)，后续每行按照1∶1的比例进行稀释。以庆大霉素为阳性对照，DMSO为阴性对照，每孔中均加入50 μL浓度约为1.5×108CFU/mL的测试菌菌悬液。96孔板在37 ℃下培养24 h后，检测610 nm处的菌悬液浊度，最终的MIC浓度为无浑浊度时的精油样品的最低浓度，实验重复3次。

抗真菌活性实验的菌种为白色念珠菌和黑曲霉，培养基为酵母霉菌专用培养基(Yeast and Mold Broth)，以两性霉素B作为阳性对照，同样采用微量稀释法进行测定，28 ℃下培养72 h后，观测真菌孢子液浊度的变化。

2 结果与分析

2.1 香樟精油不同提取方法的对比

分别计算了4种不同方法提取的精油得率，并测定了各精油样品的性状，结果如表1所示。CXE提取油呈淡绿色，具有较强的香樟精油特征性芳香气味，相对密度为0.92 g/mL，折光系数为1.46，与传统的水蒸气蒸馏提取的精油性状相近。CXE提取法的得率为1.35%，高于超临界流体萃取法，由于CXE是一种由高比例、极性的乙醇和低比例、中低极性的超临界或亚临界二氧化碳组成的特殊流体，其极性范围较纯的超临界流体更广，具有更强的溶解能力；另一方面，由于气体膨胀了液体，导致CXE流体的密度和黏度变小，溶剂的扩散性能增强，更易从物料中萃取得到更多的精油。此外，乙醚提取法的得率虽高于CXE提取，但精油的芳香气味较淡，且带有明显的乙醚气味，可能存在溶剂残留。因此，CXE属于一类安全、高效的萃取溶剂，且整个操作是在低温、隔绝氧气的条件下进行，较传统提取方法有一定的优势。

表1 不同方法所得香樟精油的比较

2.2 香樟精油的化学组成分析

通过GC-MS测定了4种不同方法提取的香樟精油化学组成，结果如表2所示。CXE提取油、SFE提取油、HD提取油和OSE提取油中分别鉴定出25种、16种、21种和22种化合物。在4种不同方法提取的香樟精油中，相对含量大于1%的共同成分有10种，分别为甲基庚烯酮、芳樟醇、1,8-桉叶油素、1-萜品烯醇、二氢香芹醇、β-萜品醇、萜烯醇、α-萜品醇、γ-萜品醇和α-长叶蒎烯，分别占CXE油、SFE油、HD油和OSE油质量分数的93.40%、96.20%、96.03%和95.41%。

表2 香樟精油的化学组成及质量分数/%

表3 香樟精油成分分类汇总分析

进一步将表2中化合物进行分类汇总，共分为倍半萜烯类碳氢化合物、无氧单萜类化合物和含氧单萜类化合物三类，结果如表3所示。由表可知，CXE提取油中的含氧单萜类化合物含量较低，但倍半萜烯类化合物质量分数为2.49%，显著高于SFE提取油、HD提取油和OSE提取油，部分解释了CXE法由于提取温度低、隔绝氧气等因素，精油中的组分不易被氧化或分解，利于保护精油中的有效成分。

2.3 抗氧化活性分析

分别测定了4种方法提取油对ABTS自由基和DPPH自由基的清除率，结果如图1所示。CXE提取油对ABTS自由基的清除率高达85.88%，显著高于SFE提取油和HD提取油，与OSE提取油差异不显著。同时，CXE提取油对DPPH的清除率为82.42%，通过单因素方差分析，其清除能力均显著高于其他3种方法提取油。萜品醇类化合物如α-萜品醇等是精油中常见的抗氧化成分[18,19]，由表3可知，在CXE提取油中，萜品醇类化合物的含量为50.98%，均高于HD提取油、SFE提取油和OSE提取油。此外，β-石竹烯是另一种常见的抗氧化成分[20]，在CXE提取油中的质量分数约为0.05%，而在其他3种方法提取油中均未检测到。由此可知，由于CXE整个操作环境为无氧、低温状态，精油中的抗氧化成分不易被破坏，因而其抗氧化活性显著高于其他3种方法提取油。

图1 香樟精油对ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力

2.4 抑菌活性分析

植物精油的抑菌活性也是评价精油品质的重要指标之一，表4为不同方法获得的香樟精油抑菌活性结果。由表4可知，对2种革兰氏阳性菌而言，仅CXE提取油对枯草芽孢杆菌的MIC值为312.5μg/mL，呈现中等活性抑菌等级，OSE提取油为弱活性抑菌等级(MIC=625 μg/mL)，而HD提取油和SFE提取油对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无抑制作用；对2种革兰氏阴性菌而言，CXE提取油对绿脓杆菌的MIC值为625 μg/mL，为弱活性抑菌等级，对大肠杆菌无抑制作用。需要指出的是，CXE提取油对两种真菌具有极强的抑菌活性，其中对白色念珠菌的MIC值为39 μg/mL，对黑曲霉的MIC值为19.5 μg/mL，均显著高于其他3种方法提取油。虽然精油抑菌机理复杂，构效关系尚未明确，但有文献表明芳樟醇、萜品醇等可能是香樟精油中的主要抗菌活性成分[21，22]，其中CXE提取油中的质量分数分别为31.22%和50.98%。此外，精油中高沸点部分的主要成分倍半萜烯类化合物，CXE提取油中含有2.49%，除对芳香油的香味起着重要作用外，同样具有抑菌活性[23]。

表4 不同方法获得的香樟精油的抑菌活性分析

3 结论

本研究采用了一种新型的绿色溶剂CXE，从香樟叶中提取精油，通过调节二氧化碳和乙醇的比例，混合流体的极性范围更广，溶解能力更高，并且良好的扩散性能使得CXE提取法的得率明显高于传统超临界流体萃取法。由于CXE提取温度低，隔绝氧气，提高了香樟精油中抗氧化成分的含量，抗氧化活性均高于其他3种方法。抑菌实验结果表明，CXE提取油对白色念珠菌和黑曲霉呈现较高的抗菌活性。CXE提取可开发成为一种提取高品质植物精油的新方法，具有一定的应用前景。