四重实时荧光PCR快速检测转基因玉米及其加工产品

王凤军 叶素丹 凌 云 周晓红

(浙江经贸职业技术学院，杭州 310012)

《2017年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示全球转基因作物商业化种植面积达到了1.898亿公顷，创历史新高，从1996年到2017年，全球转基因农作物商业化22年间，种植面积增长了约112倍。自1992年以来全球67个国家/地区的监管机构批准了来自先正达、孟山都、巴斯夫和柯迪华等跨国农业生物技术公司的4 133项监管审批，涉及26个转基因作物的476个转基因转化体。其中，1 995项食用，1 338项饲用，800项用于种植或环境释放[1]。从全球转基因作物种植品种来看，主要以大豆、玉米、棉花、油菜四大作物为主，其中转基因玉米2017年种植面积为3 384万公顷，占全球转基因种植面积的45.1%，是种植面积第二大的作物。目前全球转基因玉米共146个品系，主要有耐除草剂、抗虫、改善品质、耐旱及抗虫+耐除草剂、品质和耐除草剂等转基因性状[2]。

2018年，美国、阿根廷、澳大利亚、巴西、加拿大等13个国家签署了关于推进精准生物技术在农业领域应用的联合声明，就基因编辑农作物采取一致和可靠的措施。我国已批准的转基因生产应用安全证书并在有效期内的作物有棉花、水稻、玉米和番木瓜，但进行商业化种植的转基因作物仅有棉花和番木瓜。中国批准进口用作加工原料的转基因作物大豆、玉米、油菜、棉花和甜菜等均需获得我国的安全证书。我国制定的《农业转基因生物进口安全管理办法》《农业转基因生物加工审批办法》等，规定转基因生物标识的监督管理及标识检查验证[3,4]。

转基因作物给人们带来了优良的性状，解决了粮食短缺问题，但也存在潜在的安全性，如生态系统破坏、自然资源库污染、新型病原体产生和外来物种的侵入以及人类健康危险等[5-7]。因此有必要对转基因产品的进行外源基因检测，控制未批准的转基因产品的流通。为提高检测准确性和时效性，主要以实时荧光PCR和数字PCR为主[8-15]。Michaela Höhne等[16]应用实时荧光PCR对转基因玉米Bt11、Bt176、 Mon810和T25 品系中的35S-CaMV外源基因进行检测。梁文等[17]使用数字PCR技术对转基因玉米MON89034、MON810、MIR162中的品系特异性基因片段和内源基因进行定量分析。

本研究通过多重引物和荧光探针组合筛选，反应体系优化，特异性、重复性和灵敏性测试以及样品适用性检测等过程开发建立了四重荧光定量PCR检测技术。该技术的使用可实现一个反应管中同时检测两个靶标基因，降低试剂成本，缩短检测时间，提高检测效率，为玉米及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

10% MON810、10%Bt11、100% MON863、Bt176、GA21转基因玉米标准品；CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J273/J213，FAPAS GeMSU 56A/56B均为中国合格评定国家认可委员会(CNAS)/英国食品与环境研究院(FAPAS)能力验证样品；松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26种玉米及其深加工制品均为市售。

1.2 试剂

植物DNA提取试剂盒(69104)、 SureFood PREP Plant X(S1006)、TransStart Probe qPCR SuperMix(AQ401-02)，探针与引物委托机构合成。

1.3 方法

1.3.1 核酸样本制备

称取玉米粉、玉米片、玉米糁等干重样品40 mg或玉米汁、玉米饼和玉米米酒等湿重样品150 mg，按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，非粉末样品使用液氮研磨或匀浆器进行破碎30 s，其中洗脱液使用灭菌双纯水50 μL。玉米深加工制品采用试剂盒进行操作。样品提取后使用RNA酶对RNA进行降解，再使用NanoDrop-one核酸蛋白分析仪测试DNA的含量和纯度。

1.3.2 引物和探针设计

采用国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)转基因批准数据库检索转基因玉米批准商业化种植品系及转化事件，分析各类转化事件被转入的外源基因，选定花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)以及根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)为外源基因，选定编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作为玉米物种的内参照基因。使用Primer 5.0软件和Peimer-BLAST设计多重引物和荧光探针。荧光探针报告基团按照设备性能以及波长范围，设置NED、VIC、FAM和Cy5为报告基团，采用非荧光淬灭基团进行荧光信号收集，其中VIC和NED采用MGB分子信标荧光探针。

1.3.3 单重荧光PCR反应

反应体系为20 μL，在200 μL光学PCR反应管中依次加入：Nuclease-free蒸馏水1.2 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix (2×) 10 μL，Passsive Reference Dye II(50×) 0.4 μL，引物(10 μmol/L)0.4 μL、探针(10 μmol/L)0.2 μL和扩增模板1 μL。反应参数设置为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s共两步法，其中第二步设置40个循环。在ABI QuantStudio Q5实时荧光PCR仪进行扩增反应。每个基因设置3个平行实验，每次检测设置以转基因玉米标准品DNA为模板的阳性对照，以已知非转基因玉米样品为阴性对照，以及提取空白对照和PCR反应空白对照。

1.3.4 多重荧光PCR反应

反应体系为20 μL, 在多重荧光定量PCR反应体系加入4组检测引物和探针，TransStart Probe qPCR SuperMix，Passsive Reference Dye II和基因组DNA等成分(具体见表1)，荧光定量PCR反应参数同1.3.3。使用QuantStudioTMDesign & Analysis software进行数据分析和处理。

表1 四重荧光定量PCR的反应混合液组成

1.3.5 引物探针特异性检测

提取ACAS-T067-J273转基因玉米样本以及非转基因玉米粉样本基因组DNA，使用1.3.3单重实时荧光PCR体系进行扩增，确定样品中目标外源基因，确保基因组DNA提取的有效性。按照1.3.4四重荧光定量PCR体系进行多重检测，验证4个基因之间在多重荧光反应体系中的荧光信号是否有干扰。

1.3.6 灵敏性检测

提取ACAS-T067-J273转基因玉米样本基因组DNA，按照10倍浓度稀释5个梯度，稀释介质为Nuclease-free dd H2O。根据玉米的单倍体基因组分子质量约为2.6 pg。稀释后标准品每个反应分别为13 000、1 300、130、13、1.3拷贝。以5个梯度的标准品分别为模版，进行四重实时荧光定量反应，每个浓度设置3个重复，验证方法的灵敏性和检测范围。以拷贝数的自然对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制内源基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS的标准曲线，求得线性方程，相关系数和扩增效率。

1.3.7 适用性检测

对农贸市场、超市等流通的玉米产品及其深加工制品以及实验室收集的各种转基因玉米标准品，能力验证样品以及转基因大豆、棉花、番茄等转基因阳性样品进行四重实时荧光PCR反应，筛查检测是否含有pCaMV35S、tNOS和EPSPS外源基因。

2 结果与分析

2.1 核酸样本制备结果

用核酸蛋白分析仪测定基因组DNA的质量和浓度，所有材料的基因组DNA OD260/OD280的比值大多为1.6～2.0，经测试其浓度为50～250 ng/μL，符合荧光PCR扩增要求，统一稀释成100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

2.2 引物和探针特异性检测

按照1.3.2中的方法针对转基因玉米内参照基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS引物和多重荧光探针，序列见表2。

表2 转基因玉米特异性检测的引物和探针序列

2.3 特异性检测结果

提取转基因玉米ACAS-T067-J273和非转基因玉米ZY1711样本基因组DNA，使用上述多重荧光定量PCR体系进行转基因成分检测，验证方法的特异性。图1为转基因玉米ACAS-T067-J273和非转基因玉米ZY1711多重反应的结果，内源基因zSSIIb均产生了明显的S型扩增曲线，Ct值小于35。外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS在转基因玉米中检出，且扩增曲线呈现明显的S型，而非转基因玉米中不检出，空白对照无信号，检测基因之间无信号干扰，外源基因的反应结果与期望结果一致，表明引物探针的设计及反应体系的设置具有特异性，可用于玉米转基因成分的筛查检测。

图1 外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS以及内源基因zSSIIb四重荧光PCR反应的扩增曲线图

2.4 重复性和灵敏性检测

转基因玉米ACAS-T067-J273梯度稀释后DNA四重实时荧光PCR扩增的Ct值见表3所示，四个基因相关系数R2为0.992～0.996。同一基因同一稀释梯度范围内Ct值的变异系数较小，重复性较好。zSSIIb基因Ct值变化范围在19.26～34.39之间，标准偏差在0.048～0.837，R2为0.993，扩增效率为96.1%；外源基因pCaMV35S的Ct值变化范围在22.70～37.68，标准偏差在0.082～0.605，R2为0.992，

表3 转基因玉米多重荧光定量PCR灵敏性检测Ct值分析表

扩增效率为104%；外源基因tNOS的Ct值变化范围在24.01～37.83，标准偏差在0.160～0.876，R2为0.996，扩增效率为97.2%，外源基因EPSPS的Ct值变化范围22.84～37.45，标准偏差在0.054～0.704，R2为0.996，扩增效率为91.4%，表明该四重实时荧光PCR扩增体系稳定性较高，重复性较好，最低检测限为每20 μL反应1.3个拷贝，最低定量限为每20 μL反应13个拷贝。

2.5 样品检测结果

对购自农贸市场的松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26种玉米及其深加工制品等样品以及转基因玉米标准品和能力验证样品进行四重实时荧光PCR检测，同时按照SN/T 1204—2016《植物及其加工产品中转基因成分 实时荧光PCR定性检测方法》中所述的引物和探针、检测步骤和反应程序对样品进行检测[18]，结果见表4。经SN/T 1204—2016标准反应体系验收和盲样测试的10个转基因标准品和能力验证样品四重实时荧光PCR反应均为阳性，26个市场抽样的玉米制品分别经四重实时荧光PCR检测和标准方法检测，均为阴性。表明本实验研究开发的四重实时荧光PCR反应体系适用于玉米转基因成分的筛查检测，尤其是大量样本的快速检测。

表4 四重荧光定量PCR反应对转基因玉米、大豆标准品和CNAS/FAPAS能力验证样品的筛查检测结果

续表4

3 讨论

目前我国已批准的转基因生产应用安全证书并在有效期内的转基因玉米品系共21种，主要转入了抗虫、抗除草剂，改良α-淀粉酶、甘露糖代谢等外源基因，见表5。通过数据库中各转基因玉米产品中转入的外源基因信息，以及国内外已报道的转基因农产品抗虫、抗病、抗除草剂和耐储等相关基因的序列以及转基因启动子/终止子序列，选择3～4个常用的外源基因和内源基因作为靶标基因。对靶标基因特定序列设计引物和荧光探针，用不同报告基团(不同颜色的荧光信号)标记，通过发射波长筛选最佳的报告集团的组合，合成后用于多重荧光定量PCR，根据其扩增曲线、标准曲线和扩增效率，筛选出最适合的3～4对引物和探针用于多重荧光定量分析。

为降低多重反应中目标基因间的荧光信号干扰，通过十字交叉法和棋盘法优化荧光PCR反应参数(包括体系中Mg2+、引物、探针和模板浓度)，建立多重实时荧光定量PCR检测技术。使用阳性对照样品或阳性质粒作为标准品建立标准曲线，进行准确性和灵敏性的实验比对分析，确定多重荧光定量PCR体系中各基因的线性检测范围，分析检测灵敏度和重复性，进行多重荧光定量PCR反应体系的方法学验证。

表5 国内已批准的转基因生产应用安全证书并在有效期内的的转基因玉米品系及相关信息

各品牌的荧光定量PCR仪的通道和提供的检测光谱范围的差异，决定了在选择探针的发光基团和淬灭基团时要根据所用仪器型号设进行设置。本研究使用QuantStudio Q5实时荧光PCR仪，含有FAM/SYBR GreenI，VIC/HEX/CY3，ROX/Texas Red，Cy5，TAMARA等5色荧光检测通道，可实现同一个反应孔中同时对多个外源基因进行检测，节省试剂耗材成本，操作简易，尤其适合多样品的检测分析。

4 结论

本实验基于四重荧光PCR 技术，通过多重引物和探针筛选，反应条件优化，方法学验证等，建立了可同时对pCaMV35S、tNOS和EPSPS三 个外源基因和 zSSIIb 玉米内参照基因进行检测的体系。检测体系通过各类标准品和市场抽样样本进行适应性验证，检测结果与SN/T 1204—2016标准检测结果一致，检测方法具有较好的准确性和可靠性，适用于农作物种子品系溯源、食品原料玉米成分转基因元件检测，对玉米及其深加工制品产品市场的转基因成分标识制度的完善，规范转基因产品的市场监管，确保食品安全有重要意义。