塞来昔布对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大及MAPK/ERK通路的影响

郑香妮 侯敏

(1庆阳市人民医院心血管内科，甘肃 庆阳 74500；2武汉市东西湖区人民医院心血管内科)

心肌细胞肥大表现为细胞表面积增加和细胞中总蛋白合成增加，心脏通过心肌细胞肥大增加心输出量，是病理初期一种强有力的代偿形式，但持续的心肌肥大会引起心肌收缩功能紊乱、心室重构等，最终导致心力衰竭而威胁患者生命健康〔1,2〕。因此抑制心肌肥大对改善心功能具有重要临床意义。研究表明，环氧化酶-2抑制剂可通过影响血压、氧化应激等抑制心肌肥大，塞来昔布作为环氧化酶-2抑制剂的一种，塞来昔布可能在心肌肥大临床辅助治疗中发挥有效作用〔3,4〕。但其抑制心肌肥大的作用机制尚不完全清楚。本研究利用血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大，观察塞来昔布对心肌细胞表面积、总蛋白浓度及细胞凋亡率的影响，并探讨其对细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系及主要试剂 大鼠心肌细胞系H9c2(北纳生物，编号：BNCC337766)，塞来昔布(美国辉瑞公司，批号：J20120063)，AngⅡ(美国Sigma公司，纯度>98%)，胎牛血清和DMEM培养基(美国Gibco公司)。

1.2细胞培养 取H9c2细胞在37℃水浴快速解冻，加入5 ml DMEM培养基重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养基重悬细胞后，转入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，加入100 kIU/L青霉素和100 mg/L链霉素，放于37℃，5%CO2的无菌恒温培养箱中培养过夜。当细胞融合达到90%以上时，进行细胞传代。弃培养基，使用适量磷酸盐缓冲液(PBS)溶液冲洗细胞后，加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5 ml DMEM培养基终止消化。将细胞移入无菌离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞后，转入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，放于37℃，5%CO2的无菌恒温培养箱中培养。

1.3药物处理及分组 取上述传代后对数生长期的细胞，以1×104个/孔的密度加入96孔板中，以6×105个/皿的密度加入10 cm细胞培养皿中，将细胞分为5组：空白组(未加任何药物处理)；AngⅡ组(加入1 μmol/L的AngⅡ诱导心肌肥大)；AngⅡ+塞来昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L组(先加入1 μmol/L的AngⅡ诱导心肌肥大，后分别加入塞来昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L处理)。各组细胞放于37℃，5%CO2的无菌恒温培养箱中继续培养48 h用于后续实验。

1.4细胞形态学观察及细胞表面积测定 弃掉96孔板中细胞培养液，加入PBS冲洗细胞后，在奥林巴斯CKX53倒置显微镜下观察细胞形态学变化。每孔加入100 μl的0.1%Triton溶液，室温作用5 min以增加细胞膜通透性，吸去Triton溶液，加入PBS冲洗3次。每孔加入100 μl的1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，37℃下封闭30 min。吸去BSA溶液，加入50 μl BSA溶液稀释的β-肌动蛋白(β-actin)抗体一抗(Abcam公司)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜，清洗细胞后，加入50 μl BSA溶液稀释的罗丹明标记二抗(Abcam公司)，室温避光孵育1 h。洗涤细胞，加入50 μl 4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)溶液室温避光染色10 min，清洗细胞，在荧光显微镜下观察并拍照，随机选择10个细胞，使用NIH图像分析软件计算细胞表面积。

1.5细胞总蛋白浓度测定 收集各组细胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(碧云天生物技术研究所)震荡混匀，冰上放置30 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液加入新的无菌离心管中，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测各组细胞中总蛋白浓度。

1.6细胞凋亡测定 弃掉96孔板中细胞培养液，加入PBS冲洗细胞后，加入预冷的20%乙醇固定24 h，离心收集细胞并用PBS冲洗3次。参照Annexin-V/碘化丙啶(PI)试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)说明，先加入预冷的结合缓冲液重悬细胞，再分别加入5 μl Annexin-V和10 μl PI涡旋混匀，室温避光反应10 min。使用BD LSRFortessa X-20流式细胞仪(New Discovery公司)检测各组细胞凋亡率。

1.7细胞中p38MAPK、ERK1/2、磷酸化(p)-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表达检测 收集培养皿中细胞，加入预冷的PBS反复冲洗2次，加入1 ml RIPA裂解液吸打混匀，提取细胞总蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的蛋白，低温下转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，封闭2 h。加入1∶1 000稀释后的p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK抗体一抗(Abcam公司)，4℃孵育过夜。加入1∶5 000稀释的辣根过氧化酶标记二抗(Abcam公司)，室温孵育1 h，PBS洗膜3次。加入电化学发光液(北京索莱宝科技有限公司)中显色后，放入GelDoc-ItT S3全自动凝胶成像系统(美国UVP)下曝光、拍照。以GAPDH为对照，应用Image J软件分析各组细胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1塞来昔布对细胞形态学的影响 正常H9c2心肌细胞呈肌细胞样贴壁生长，与空白组比较，AngⅡ组细胞形态增大，不规则排列，细胞贴壁不牢，漂浮细胞增多；与AngⅡ组比较，塞来昔布各处理组细胞形态变小，漂浮细胞减少。见图1。

2.2塞来昔布对细胞表面积的影响 与空白组比较，AngⅡ组细胞表面积明显增大(P<0.05)；与AngⅡ组比较，塞来昔布处理各组细胞表面积明显减小(P<0.05)；AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和塞莱昔布100 mg/L组细胞表面积比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著大于空白组(P<0.05)；与AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和AngⅡ+塞来昔布100 mg/L组比较，AngⅡ+塞来昔布150 mg/L组细胞表面积明显减小(P<0.05)，与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表1。

2.3塞来昔布对细胞中总蛋白浓度的影响 与空白组比较，AngⅡ组细胞中总蛋白浓度明显升高(P<0.05)；与AngⅡ组比较，塞来昔布处理各组细胞中总蛋白浓度明显降低(P<0.05)；AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和AngⅡ+塞来昔布100 mg/L组细胞中总蛋白浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于空白组(P<0.05)；AngⅡ+塞来昔布150 mg/L组细胞中总蛋白浓度较AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和AngⅡ+塞来昔布100 mg/L组明显降低(P<0.05)，与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4塞来昔布对细胞凋亡率的影响 与空白组比较，AngⅡ组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与AngⅡ组比较，塞来昔布各处理组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；随塞来昔布浓度增加，细胞凋亡率呈逐渐降低趋势(P<0.05)。见表1和图3。

2.5塞来昔布对细胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表达的影响 与空白组比较，AngⅡ组细胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05)；与AngⅡ组比较，塞来昔布各处理组细胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相对表达量差异无统学意义(P>0.05)，但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量均明显增加(P<0.05)，且AngⅡ+塞来昔布150 mg/L组细胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量明显高于AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和AngⅡ+塞来昔布100 mg/L组(P<0.05)。见表2和图4。

图1 细胞形态学变化(×100)

图2 细胞荧光染色(DAPI，×400)

表1 各组细胞表面积、总蛋白含量及细胞凋亡率比较

图3 细胞凋亡流式细胞图

表2 各组细胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量比较

1～5：空白组；AngⅡ组；AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组;AngⅡ+塞来昔布100 mg/L组;AngⅡ+塞来昔布150 mg/L组

3 讨 论

机械刺激、化学等因素刺激下均可导致心肌蛋白合成增加，心肌细胞体积增大，而发生心肌肥大，研究表明，心肌肥大是许多心血管疾病发生发展过程中共有的病理过程，是导致心力衰竭的独立危险因素〔5,6〕。研究表明，靶向心肌肥大是预防及治疗心力衰竭的新的有效手段〔7〕。AngⅡ是调节血压和体液的重要激素，可通过升高血压或直接刺激心肌细胞合成肌蛋白增加，诱导心肌细胞肥大〔8,9〕。

塞来昔布是一种环氧化酶2抑制剂，动物实验表明，心肌细胞环氧化酶2的高表达可导致心肌肥厚显著增加，而塞来昔布治疗可不同程度缓解心肌肥大及心肌收缩功能障碍，延缓心肌肥大向心力衰竭转变，降低死亡率〔10,11〕。本研究说明塞来昔布对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大具有抑制作用，与Wang等〔12〕研究结果基本一致。进一步分析说明塞来昔布对心肌肥大的抑制具有剂量依赖性，

心肌细胞肥大凋亡、心肌纤维化导致心肌收缩和舒张功能障碍，心室顺应性增加是慢性心力衰竭的重要病理改变〔13,14〕。Zhang等〔15〕研究报道，塞来昔布通过减少细胞凋亡、降低炎症反应和氧化应激水平，抑制压力超载诱导的心肌肥大。本研究提示塞来昔布可能通过抑制心肌细胞凋亡而抑制心肌肥大。p38MAPK和ERK1/2是MAPK/ERK信号通路的主要组成部分，MAPK/ERK信号通路是介导细胞增殖、细胞分化、细胞周期和细胞凋亡的重要信号系统〔16,17〕。本研究提示塞来昔布可促进p38MAPK和ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信号通路，这可能与塞来昔布抑制心肌细胞凋亡有关。

综上，塞来昔布能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞表面积增大，蛋白生成，有效抑制心肌细胞肥大。此外其可能通过促进心肌细胞中p38MAPK、ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信号通路，抑制心肌细胞凋亡，在抑制心肌肥大进展过程中发挥重要作用。