慢病毒介导TFF3基因转染A549细胞对NF-κB表达的影响

赵如华 宋佳悦 赵晓蕊 赵柠 房涛 张静 吴靖芳

(1河北北方学院形态学实验室，河北 张家口 075000；2张家口市第一医院)

肺癌是最常见的恶性肿瘤疾病，全世界每年有将近1.4千万人死于肺癌〔1〕，是发病率和死亡率增长最快，对生命威胁最严重的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌是肺癌主要类型，约占肺癌患者的85%〔2〕。近几年肺癌发病率逐年升高，在男性恶性肿瘤发病率中占第一位，在女性占第二位，肺癌易转移和复发，是引起中老年肿瘤患者死亡的主要原因〔3〕，因此研究肺癌细胞的增殖、转移机制对探讨肺癌的靶向治疗和有效的候选诊断标志物具有临床意义。三叶因子(TFF)3是TFF家族重要成员，近几年研究表明TFF3在多种肿瘤中高表达，与肿瘤细胞的生长、播撒、转移和迁移有密切关系。核因子(NF)-κB是重要的转录因子，它被异常激活后可通过调节细胞周期蛋白及凋亡相关蛋白的异常表达而促进肿瘤的发生与发展〔4〕。研究发现TFF3能够激活肠上皮细胞中NF-κB，并通过NF-κB 抑制细胞凋亡〔5〕。本研究旨在探讨TFF3对人非小细胞肺癌A549细胞NF-κB表达变化的影响，通过慢病毒包装质粒转染A549细胞建立稳定过表达和敲低TFF3表达的A549细胞株，探讨NF-κB、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2表达变化意义。

1 材料与方法

1.1材料 人非小细胞肺癌A549细胞购自中国科学院细胞库(SCSP-503)，F12K培养基、DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司，293T细胞、TFF3增强及沉默质粒由河北北方学院形态学实验室提供，Lenti-PacTM慢病毒包装试剂盒购自广州复能基因有限公司。Trizol、FastQuant RT Kit (With DNase)cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix购自Thermo Fisher Scientific有限公司，DNA marker(DM2000)购自康为世纪生物科技有限公司。蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，小鼠抗人β-actin抗体、羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G、羊抗兔IgG购自康为世纪生物科技有限公司，小鼠抗人NF-κB p65抗体购自苏州睿瀛生物技术有限公司，兔抗人TFF3抗体购自Abcam生物公司，兔多抗Bcl-2购自武汉博士德生物工程有限公司，兔多抗CyclinD1购自Santa Cruz公司，超敏ExPlus ECL化学发光检测试剂购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，PCR引物通过NCBI-Primer-BLAST设计并验证，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2细胞培养 A549、293T细胞分别培养于含10%胎牛血清的F12K、DMEM培养基内，置于37℃，5%CO2细胞培养箱内(Thermo Fisher)培养，每隔2～3 d更换一次培养基，待细胞汇合80%～90%时1∶2或1∶3进行传代，取对数生长期细胞用于实验操作。

1.3慢病毒包装TFF3增强和沉默质粒 慢病毒包装前，293T细胞按5×104个/孔接种于24孔板内，加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，在5% CO2、37℃的条件下铺板培养细胞，达到70%～80%融合率时进行慢病毒包装。将TFF3基因全长慢病毒表达载体质粒(TFF3)及对照(Vec)、TFF3小发卡RNA慢病毒表达载体的质粒(shTFF3)及对照(shCK)、eGFP 阳性对照质粒按照说明书制备DNA-EndoFectin转染复合物并加入孔板中，在5%CO2、37℃的条件下培养12 h后，去除含有转染复合物的旧培养液，每孔添加500 μl含5%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养液，并加入1 μl TiterBoost增强剂，继续在5%CO2、37℃的条件下培养36 h后收集细胞培养液，以500 r/min离心10 min去除细胞碎片，吸取上清获得慢病毒液。根据实验室慢病毒包装经验，以慢病毒液与培养基1∶3比例加入前1 d已于24孔板按1×105个/孔铺好的A549细胞中过夜，24 h后去除慢病毒液加入F12K全培养基，48 h后可见eGFP阳性对照质粒转染细胞出现绿色荧光，再培养48 h后加入含2 μg/ml嘌呤霉素的F12K培养基进行筛选，每隔3 d换液，2 w后获得稳转细胞株，并通过qRT-PCR和Western印迹进行验证。

1.4实时荧光定量PCR法检测目的基因的表达水平 将铺满25 cm2培养瓶内A549-TFF3、A549-Vec、A549-shTFF3、A549-shCK四株细胞胰酶消化后置灭酶EP管中，Trizol法分别提取四株细胞的总RNA，Nanodrop(Thermo Fisher)测定RNA浓度，根据说明书按照1 μg总RNA模板量进行逆转录为cDNA，按照试剂盒说明书配制PCR反应液(总体系10 μl，cDNA原液1∶10稀释后取1 μl，上下游引物各0.5 μl，PCRMix：5 μl，ddH2O：3 μl)，而后通过ABI7300实时荧光PCR仪进行PCR反应，程序设置如下：①UDG酶激活(50℃，2 min)，②预变性(95℃，2 min)，③变性(95℃，15 s)，④退火/延伸(60℃，1 min)，第3、4步总共40个循环，采用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。TFF3基因PCR产物加入4×DNA上样缓冲液后进行1.5%琼脂糖凝胶水平电泳并通过Tanon1600凝胶成像系统进行观察和拍照。引物序列：β-actin上游5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′ 、下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATAC-3′；NF-κB上游5′-AAATGGGCTACACCGAAGCA-3′、下游5′-TTGCGGAAGGATGTCTCCAC-3；Bcl-2上游5′-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-3′ 、下游5′-AGGACCAGGCCTCCAAGCT-3′；CyclinD1上游5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′ 、下游5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′ 。

1.5Western印迹蛋白检测 消化、洗涤、收集A549-TFF3、A549-Vec、A549-shTFF3、A549-shCK四株细胞后加入0.5 ml细胞裂解液，4°静置2 min，而后加入1 ml抽提试剂，振荡混匀，4℃静置10 min，10 000 r/min 4℃离心10 min，保留中间蛋白膜，加入1 ml纯乙醇洗涤沉淀。10 000 r/min 4℃离心3 min，室温空气干燥蛋白沉淀，视蛋白膜大小加入200～500 μl 2%SDS 95℃金属浴溶解蛋白膜，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，计算含30 μg蛋白的体积数，加入4×上样缓冲液与ddH2O补足至10 μl，配制上样蛋白混合液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜孵育一抗：β-actin(1∶3 000)、TFF3(1∶1 000)、NF-κB(1∶500)、Bcl-2(1∶200)、CyclinD1(1∶500)4℃过夜，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次，二抗(1∶5 000)室温下摇床1 h，PBST清洗3次，膜上蛋白面滴加ECL发光显色液显影，通过OmegaLum W(Aplegen，美国)化学发光凝胶成像系统进行观察和拍照。Image J分析各蛋白条带灰度值，以目的蛋白/β-actin的比值为该蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理 应用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1慢病毒转染后稳转株建立 慢病毒液转染96 h后用含2 μg/ml嘌呤霉素的F12K培养基进行筛选，7 d后eGFP对照组细胞90%以上为绿色荧光(图1)，再继续筛选7 d获得的细胞进行PCR及Western印迹TFF3 mRNA及蛋白表达水平的鉴定。结果显示A549-TFF3细胞TFF3 mRNA较Vec组显著增高(655.00±135.00 vs 1.00±0.04，P<0.01)，琼脂糖水平电泳观察TFF3条带明显亮于Vec组，蛋白水平较Vec组显著增高(3.39±0.05 vs 0.88±0.05，P<0.01)。A549-shTFF3细胞株中TFF3 mRNA沉默效率约为75%，琼脂糖水平电泳显示TFF3条带明显弱于shCK组(0.25±0.03 vs 1.00±0.05，P<0.01)，shTFF3蛋白水平较shCK组明显降低(0.20±0.03 vs 0.80±0.05，P<0.01)，见图2，图3。

2.2NF-κB mRNA、Bcl-2 mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量变化 与Vec组相比，TFF3组A549细胞中NF-κB、Bcl-2 、CyclinD1 mRNA水平表达明显增高，与shCK组比较，而shTFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA水平均明显降低(均P<0.01)。见表1。

M：marker

图3 Western印迹验证TFF3蛋白表达水平

表1 TFF3对A549细胞相关分子基因水平的影响

2.3NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白在过表达及沉默TFF3基因的A549细胞中的表达变化 TFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表达水平均明显高于Vec组(P<0.05，P<0.01)，而在shTFF3组蛋白表达水平明显著低于shCK组(P<0.01)。见表2，图4。

表2 TFF3对A549细胞相关分子蛋白水平的影响(平均灰度值，

图4 TFF3对A549细胞NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表达水平的影响

3 讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤，被确诊的病例逐年增多，5年生存率低于15%，而且复发率较高〔6〕，非小细胞肺癌是肺癌中主要类型，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。肺癌恶性属性的潜在机制尚未阐明，因此缺乏有效地治疗。研究非小细胞肺癌恶性发生发展机制对寻找有价值的肿瘤标志物、疾病治疗、疗效监测、预后判断均具有重要的临床意义。大量增加的证据表明TFF3在多种肿瘤中高表达，包括乳腺癌〔7〕、胃癌〔8〕、结肠癌〔9〕、肝癌〔10〕、前列腺癌〔11〕、甲状腺癌〔12〕等，高表达的TFF3促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为。TFF3最初被证实是重要的消化道黏膜保护因子，主要由肠道杯状细胞所分泌，在胃肠道黏膜受到损伤后TFF3分泌的增加促进细胞的增殖和迁移从而有利于黏膜的修复〔13〕，当TFF3异常过多增加时将导致肿瘤的发生与发展。有实验表明，TFF3在肺癌患者血清中明显增高，可作为肺癌的生物学标记物〔14〕。本研究结果表明，慢病毒转染的方法能够通过病毒介导显著提高基因的转染效率，实现目的基因的高效表达。

NF-κB是重要的核转录因子，在刺激因素作用下，由静息状态转为激活状态，胞质中的NF-κB进入细胞核中与相应基因的启动子或增强子的特异性NF-κB元件结合，调控下游靶基因蛋白的表达而发挥相应的功能，包括增殖调节基因(CyclinD1 、C-myc等)、凋亡相关基因(Bcl-xl、Bcl-2等)等，参与调控细胞生长、分化、增殖、凋亡、血管生成等过程，与多种恶性肿瘤的发生、发展、抵抗治疗的过程密切相关〔15～17〕。研究表明TFF3能够激活肠细胞中NF-κB，并能够抵抗凋亡〔18〕。本研究结果提示在A549细胞中TFF3基因能够激活NF-κB的表达，进而诱导下游基因的进一步表达。CyclinD1是目前研究最多的细胞周期蛋白，是调节G1-S期转换的重要因子，与多种肿瘤的发生发展相关〔19〕，CyclinD1表达增加时，G1期缩短，促进细胞进入S期，细胞处于持续增殖的状态，导致肿瘤的形成。CyclinD1是NF-κB的重要靶基因，其启动子上含有两个与NF-κB结合的位点，NF-κB的激活可CyclinD1的高表达，促进肿瘤细胞的增殖〔20〕。本实验结果进一步证实CyclinD1与NF-κB的表达变化是一致的，高表达的NF-κB促进了CyclinD1的激活，促进肿瘤细胞的生长，而沉默TFF3的A549细胞中NF-κB水平降低，CyclinD1表达减弱，引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡的发生，CyclinD1表达水平的降低还可能与细胞周期依赖性激酶(CDKs)抑制因子P21、P27被激活有关，抑制了CDKs复合物对细胞周期的调控，抑制细胞由G1期向S期的转变。Kannan等〔21〕研究表明TFF3可通过上调Bcl-2表达促进乳腺癌细胞克隆性生长，NF-κB可激活含有κB的Bcl-2和Bcl-XL编码基因的转录活性，增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，因此通过本实验结果推测过表达的TFF3可能通过上调NF-κB活性促进Bcl-2的表达，增强了A549细胞的抗凋亡能力，促进了癌细胞的生长。综上，TFF3可通过NF-κB通路影响非小细胞肺癌A549细胞的细胞周期、细胞凋亡的进程。