桂枝水提物诱导人结直肠癌SW480细胞周期进程及其凋亡机制

孙鹏达 孙冬 (吉林大学第二医院，吉林 长春 130041)

结直肠癌是当今严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率位居第3位和第4位〔1〕，尤其年轻结直肠癌患者逐年增多，40%～50%的患者初诊时已有远处转移，因此急需研究能够有效控制结直肠癌的复发、转移的新型药物和新的治疗方案。研究表明桂枝提取物桂皮醛为桂枝的主要活性物质，其含量占药材的1%〔2〕，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗细菌等广泛的生物学活性，故本研究通过体外培养人结直肠癌SW480细胞，应用桂枝水提物对其进行干预，探讨其对SW480细胞增殖的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞药物及试剂 人结直肠癌SW480细胞株由吉林省肿瘤医院肿瘤研究所馈赠，桂枝水提物成分分析由长春中医中药研究院完成，称取中药桂枝1 000 g，将其研磨成粉状，用适量的蒸馏水煎煮，持续30 min，过滤，去除沉渣。收集滤液，重复3次，获取滤液经5 000 r/min，离心30 min，弃去沉淀物，留取上清液，置冻干机内冻干，收集冻干粉存放于干燥处，进一步分离纯化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、RPMI1640培养基购于美国Sigma公司，胎牛血清购于长春生物制品研究所。桂皮水提物指纹图谱，其主要成分为：桂皮醛、肉桂酸、桂皮酸酯及香豆素等，见图1。

图1 中药桂枝的HPLC指纹图谱分析

1.2MTT比色法检测细胞增殖情况 取对数生长期的sw480细胞，调细胞数为4×104/ml接种于96孔细胞培养板内，置37℃ 5%CO2培养箱内静置培养12 h，待细胞生长达到80%融合状态，共分4组，对照组只含有细胞和等体积培养液，低、中、高剂量组分别加入100、200、400 mg/ml桂枝水提物，持续观察48 h后于培养结束前6 h每孔内分别加入20 μl/ml(5 mg/L)MTT试剂，继续培养6 h后，吸弃上清，每孔内加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，置摇床上低速震荡10 min，促使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪490 nm处测量各孔吸光度A值，计算细胞增殖抑制率。细胞抑制率=(1-加药组细胞A值÷对照组细胞A值)×100%

1.3流式细胞术检测细胞周期 细胞培养及分组同1.2，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行。培养结束后，弃去上清液分别加入0.25%胰蛋白酶消化液1 ml，消化2～3 min后，弃去消化液，加入3 ml培养液，分散细胞，离心弃上清，调细胞数为1×106/ml，70%乙醇固定，置4℃冰箱内保存，供流式细胞仪检测细胞周期进程。

1.4透射电镜技术观察细胞超微结构 细胞培养及分组同1.3，实验结束后分别收取不同浓度的桂枝水提物作用后的SW480细胞悬液于锥形离心管内，离心沉淀1 000 r/min，离心10 min，离心去上清，细胞沉淀物经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电子显微镜观察。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1桂枝水提物对SW480细胞增殖的影响 与对照组比较，各剂量桂枝水提物均可显著降低细胞增殖的吸光度A值，各剂量桂枝水提物对SW480细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 不同浓度桂枝水提物对SW480细胞增殖的影响

2.2桂枝水提物对SW480细胞周期的影响 桂枝水提物对SW480细胞周期进程均有抑制作用，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，且细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 不同浓度桂枝水提物对SW480细胞周期及凋亡率的影响

2.3透射电子显微镜结果 不同浓度桂枝水提物作用于SW480细胞后，可见细胞内有大量空泡存在，线粒体肿胀，细胞核染色质趋边凝等，可见凋亡率，见图2。

图2 透射电镜观察SW480超微结构

3 讨 论

近年来，从天然植物中获取抗肿瘤药物的研究备受关注，并成为研究热点〔4〕。桂枝作为传统中药可用来治疗许多疾病，如：风湿、发热、月经失调等，体外研究桂枝水提物对多种肿瘤细胞的生物学作用机制，结果表明，桂枝水提物桂皮醛对人胃癌细胞BCG823细胞，人乳腺癌细胞MDA-MB-4355细胞，人宫颈癌细胞Hela细胞株和人肺癌细胞株A549，均有诱导凋亡及抑制细胞增殖作用〔5〕。因此，本研究应用MTT比色法检测不同浓度桂枝水提取物，对SW480细胞的增殖抑制作用获得较为满意的结果。MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中脱氢酶吸收，并将MTT试剂还原成蓝色的甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数目及细胞活化状态呈线性关系〔6〕，故MTT实验可客观反映抗肿瘤药物对细胞增殖抑制效果，因此该实验被广泛用于抗肿瘤药物筛选和细胞毒性的实验研究，具有一定的客观性。此外，线粒体作为半自主细胞器，在细胞能量代谢和氧自由基生成过程中扮重要角色，极易受外界因素损伤，导致线粒体功能改变，细胞增殖受抑。

流式细胞仪结果显示不同浓度的桂枝水提物对SW480细胞增殖周期各时相均有不同程度的抑制作用，细胞周期高度保守，受各种细胞因子严格控制〔7〕，任何一个环节失控即可发生功能和形态学改变。本研究结果表明SW480细胞对桂枝水提物具有一定浓度依赖性，均表现为G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，从而使G2/M期细胞相对增多，G2/M期细胞增多是细胞受损伤的普遍反映，这一点从细胞凋亡率上得到了体现。本研究中细胞周期和细胞凋亡结果显示SW480细胞经桂枝水提物作用后，促使SW480细胞DNA合成下降，有丝分裂减少，凋亡比例增加，这一结果与Ka等〔8〕实验结果一致，提示桂枝水提物对SW480细胞具有一定的增殖抑制作用。有可能成为人类结直肠癌治疗的有效药物。

此外，本研究还应用透射电子显微镜观察经不同浓度桂枝水提物作用后SW480细胞亚细胞结构改变，可见线粒体肿胀，有气泡形成，细胞核染色质浓染，趋边，凝集，纺锤体断裂，可见凋亡小体改变。文献报道〔9〕，桂枝提物属于细胞周期特异性药物，主要作用于细胞周期的G1期，并通过与微管蛋白的作用，导致微管解聚，破坏细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使细胞有丝分裂停止于G1期，促使细胞凋亡，达到抑制细胞增殖的目的。因此，在分子生物学水平检测桂枝的生物活性。进一步阐明桂枝提物抗肿瘤机制。

综上所述，桂枝水提物对SW480细胞增殖抑制作用具有一定浓度依赖性，尤其对细胞周期进程阻滞和诱导细胞凋亡效果明显，为了提高桂枝水提物的抗癌效果，同时减轻药物的不良反应，探索新的药物剂型，在降低毒副作用的基础上通过增加剂量，以及延长作用时间对桂枝水提物进行修饰改造，以期达到对人类结直肠癌治疗开辟新的治疗途径。