二甲双胍联合COX-2选择性抑制剂塞来昔布对胃癌SGC-7901细胞增殖凋亡的影响

张永恒， 常廷民

1.新乡医学院第一附属医院 1.药学部； 2.消化科，河南 卫辉 453100

二甲双胍是临床上治疗2型糖尿病的常用药物，除了有降糖作用外，其还可通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡对卵巢癌、结肠癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤表现出较好的抗肿瘤作用[1-3]。环氧化酶-2(COX-2)是一种前列腺素过氧化物合成酶，其在乳腺癌、胶质瘤和胰腺癌等多种肿瘤组织中异常高表达，可通过诱导细胞增殖、抑制细胞凋亡和促进血管生成等促进肿瘤的发生、发展[4-6]；已有研究[7-8]报道指出，COX-2在胃癌组织中异常高表达，与淋巴结转移、肿瘤分期和5年生存率等有关，抑制其表达可有效提高胃癌的治疗效果。塞来昔布是一种COX-2选择性抑制剂，因其靶向作用强和不良反应小等优点在抗肿瘤方面备受关注。近年来有研究[9]报道，二甲双胍和塞来昔布两药联用可起到协同抗胰腺癌的作用，但两者联合应用是否有更好的抗胃癌价值尚未可知。本研究以人胃癌SGC-7901细胞为研究对象，通过二甲双胍和塞来昔布单独或联合用药探讨其抗肿瘤的分子机制，以期为胃癌的药物治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器RPMI 1640购自美国GIBCO公司，新生胎牛血清购自杭州四季青，胰蛋白酶购自美国BIOBASICI公司，MTT试剂和二甲双胍购自美国Sigma公司，COX-2选择性抑制剂塞来昔布购自美国辉瑞公司。Cyclin D1抗体购自美国BD公司，PCNA抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物公司，β-actin抗体、全蛋白抽提试剂盒、Braford蛋白含量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL检测试剂盒均购自南京凯基生物公司，PI细胞周期检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自美国BD公司，PVDF膜购自美国PALL公司，酶标仪购自美国BIO-RAD公司，凝胶成像分析系统购自美国Stratagene公司，CO2细胞培养箱购自日本SANYO公司。

1.2细胞培养人胃癌SGC-7901细胞购自美国ATCC。采用质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养基于湿度95%、温度37 ℃和体积分数为5%的CO2培养箱内常规培养。

1.3MTT法检测收集长势良好的对数生长期SGC-7901细胞，经胰蛋白酶消化后，制备浓度为5×105ml-1的细胞悬液，以每孔100 μl接种至96孔细胞板上，常规培养过夜。加入终浓度为5、10、15、20和25 mmol/L 二甲双胍或终浓度为20、40、80、100和120 μmol/L 塞来昔布，并以不加药物处理的细胞作为对照。每个处理组设置5个复孔。置于培养箱内常规培养24、48和72 h后，每孔加入浓度为5 g/L的MTT试剂20 μl作用4 h，弃培养液后，加入150 μl二甲基亚枫，震荡反应20 min。选取490 nm检测波长，以酶标仪检测每孔的吸光度(OD)值。以无细胞的培养液作为空白调零组，按照存活率(%)=100%×(药物组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)计算各组细胞的存活率。每组细胞重复检测3次。后期实验：取对数生长期的SGC-7901细胞，以常规培养24 h后，将其分为4组：对照组(未加药)、二甲双胍组(加入浓度为10 mmol/L二甲双胍)、塞来昔布组(加入浓度为100 μmol/L塞来昔布)和联合组(加入浓度为10 mmol/L二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布)，按照分组给予处理72 h后，采用MTT法检测各组细胞的存活率。

1.4流式细胞仪检测取对数生长期的SGC-7901细胞，以每孔2×105个细胞接种至6孔细胞板上，常规培养24 h后，将其随机分为对照组、二甲双胍组、塞来昔布组和联合组，按照1.3中的处理方式分别给药作用72 h后，收集各组细胞，经磷酸缓冲液洗涤后，分别参照细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞的周期变化及凋亡率。

1.5Westernblotting检测收集给药作用72 h的对照组、二甲双胍组、塞来昔布组和联合组细胞，根据全蛋白抽提试剂盒说明书提取总蛋白，并以Braford法检测总蛋白的浓度。将经沸水浴处理后变性的蛋白样品，以每孔60 μg上样至质量浓度为120 g/L SDS-PAGE凝胶孔中进行电泳。待电泳分离结束后，转至PVDF膜。经质量浓度为50 g/L 脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h后，依次加入一抗(4 ℃，24 h)和二抗(37 ℃，1 h)孵育。待充分作用后，避光条件下加入ECL试剂显影，最后采用图像分析仪扫描分析。

2 结果

2.1二甲双胍和塞来昔布单用对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响二甲双胍和塞来昔布均能够呈浓度-时间依赖性抑制SGC-7901细胞增殖(P<0.05)。10 mmol/L 二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布在72 h时，SGC-7901细胞的细胞存活率接近IC50值(见表1、表2)。故后期选用10 mmol/L二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布联合作用72 h进行实验。

表1 不同浓度的二甲双胍对SGC-7901细胞增殖的影响Tab 1 Effect of Metformin with different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cells %

注：与0 mmol/L相比，aP<0.05。

表2 不同浓度的COX-2选择性抑制剂塞来昔布对SGC-7901细胞增殖的影响Tab 2 Effects of different concentrations of COX-2 selective inhibitor Celecoxib on proliferation of SGC-7901 cells %

注：与0 mmol/L相比，aP<0.05。

2.2二甲双胍和塞来昔布单用或联合对SGC-7901细胞增殖的影响与对照组相比，10 mmol/L二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布均可使SGC-7901细胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比减少(P<0.05)，但二甲双胍对G2期细胞无明显影响(P>0.05)，而塞来昔布可使G2期细胞所占百分比降低；与二甲双胍或塞来昔布单药相比，两药联用可增加G0/G1期细胞百分比，减少S期细胞百分比(P<0.05)。与对照组相比，二甲双胍和塞来昔布均可使SGC-7901细胞的存活率降低(P<0.05)，两药联合能够显著增强二甲双胍或塞来昔布单药对SGC-7901细胞增殖的抑制作用(P<0.05)(见表3)。

表3 二甲双胍和塞来昔布单用或联合对SGC-7901细胞增殖的影响

注：与对照组相比，aP<0.05；与二甲双胍组相比，bP<0.05；与塞来昔布组相比，cP<0.05。

2.3二甲双胍和塞来昔布单用或联合对SGC-7901细胞凋亡的影响10 mmol/L二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布作用48 h后，SGC-7901细胞的凋亡率较对照组均明显升高(P<0.05)，而两药联用后，SGC-7901细胞的凋亡率明显高于二甲双胍和塞来昔布的单药作用(P<0.05，见图1和表4)。

2.4二甲双胍和塞来昔布单用或联合对SGC-7901细胞中相关蛋白表达的影响10 mmol/L二甲双胍和100 μmol/L塞来昔布处理SGC-7901细胞后，均能够使细胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2表达降低，而Bax表达升高(P<0.05)；联合用药后，细胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2的表达变化明显大于二甲双胍和塞来昔布的单药作用(P<0.05，见图2、表5)。

图1 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率Fig 1 The apoptosis rate of cells detected by flow cytometry in each group

组别凋亡率对照组2.37±0.12二甲双胍组18.56±1.05a塞来昔布组22.13±2.26a联合组29.64±2.18bcF值144.680P值0.000

注：与对照组相比，aP<0.05；与二甲双胍组相比，bP<0.05；与塞来昔布组相比，cP<0.05。

图2 Western blotting 检测各组细胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2蛋白的表达Fig 2 Expressions of PCNA, Cyclin D1, Bax and Bcl-2 proteins in each group detected by Western blotting

组别PCNACyclin D1BaxBcl-2对照组0.82±0.050.87±0.060.23±0.020.46±0.04二甲双胍组0.52±0.03a0.63±0.05a0.32±0.03a0.24±0.03a塞来昔布组0.48±0.03a0.41±0.03a0.46±0.03a0.20±0.02a联合组0.28±0.02bc0.25±0.03bc0.73±0.05bc0.12±0.01bcF值126.894110.380121.61784.667P值0.0000.0000.0000.000

注：与对照组相比，aP<0.05；与二甲双胍组相比，bP<0.05；与塞来昔布组相比，cP<0.05。

3 讨论

发病率和死亡率很高的胃癌是威胁我国民众健康的重大公共卫生问题。目前针对失去手术根治机会的晚期胃癌患者，化疗为主的综合治疗仍是其治疗的主要方式，尽管患者的生存期有所延长，但后期带来的不良反应也极大，寻找安全有效的治疗药物一直是胃癌领域的研究热点。二甲双胍是治疗糖尿病的降糖药物，塞来昔布是一种COX-2选择性抑制剂，两者不良反应小，且均有较好的抗肿瘤价值。GUO等[10]研究指出，二甲双胍可通过调控LKB1/AMPK信号通路抑制非小细胞肺癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，并促进肿瘤细胞凋亡；KATO等[11]通过体内和体外试验证实二甲双胍通过调控miRNAs来抑制人胰腺癌细胞增殖和肿瘤生长。WANG等[12]研究发现，塞来昔布可通过抑制NF-κB途径诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞在G1期。CHIANG等[13]指出，COX-2在口腔癌中的过度表达增加了淋巴结转移，以塞来昔布处理的移植瘤小鼠可通过阻断波形蛋白、细胞黏附分子和转录因子等抑制上皮间质转化和细胞迁移。目前，关于二甲双胍或者塞来昔布抗胃癌的作用已得到证实，如CHEN等[14]研究指出，二甲双胍可通过抑制HIF1α/PKM2信号通路降低胃癌细胞的存活、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞；曹宇勃等[15]指出，塞来昔布可通过抑制PI3K/Akt活化，增强雷帕霉素抗胃癌BGC823细胞生长的作用。近年来有报道[9]指出，二甲双胍和塞来昔布联合用药可起到协同抗胰腺癌细胞增殖，并激活Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡的作用，那么二甲双胍和塞来昔布联合是否抗胃癌效果更佳？我们以不同浓度的二甲双胍和塞来昔布处理体外培养的SGC-7901细胞后发现，两者均能够呈时间-剂量效应抑制SGC-7901细胞的增殖。以接近IC50值浓度的二甲双胍和塞来昔布单独或联合处理72 h后，与二甲双胍和塞来昔布单独处理组相比，联合用药组中SGC-7901细胞的存活率明显降低，细胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比减少，并且细胞凋亡率明显升高。提示，二甲双胍和塞来昔布联用可起到协同抗胃癌的作用。

二甲双胍和塞来昔布抗肿瘤发生、发展的机制尚不完全清楚。董丽儒等[16]研究发现，二甲双胍可通过抑制细胞增殖核抗原PCNA和Ki-67及细胞周期蛋白Cyclin D1的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，增加细胞凋亡。PATEL等[17]报道指出，二甲双胍通过下调Bcl-2和上调Bax表达诱导卵巢癌细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞在G0/G1期和S期。同时，塞来昔布也可以通过调控PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的表达发挥抗肿瘤作用。例如：SETIA等[18]发现，塞来昔布抗结肠癌的分子机制与抑制PCNA和Bcl-2表达有关；LIU等[19]指出，塞来昔布可通过调控Bcl-2和Cyclin D1表达抑制鼻咽癌HONE1细胞增殖。PCNA仅表达在增殖细胞核中，可反映DNA复制的活跃程度，Cyclin D1在调控细胞从G1期进入S期过程中发挥着重要的调控作用，细胞周期调控异常往往会导致细胞增殖的失控，PCNA和Cyclin D1常常被作为评估细胞增殖活性的重要指标；Bcl-2和Bax是公认抑凋亡基因和促凋亡基因，两者常被作为评估细胞凋亡的重要指标；PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的异常表达均与胃癌的发生、发展密切相关[20-21]。为了探讨二甲双胍联合塞来昔布抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的分子机制，我们采用Western blotting进一步检测SGC-7901细胞中PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果发现，联合用药组细胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达的下降幅度及Bax蛋白表达的升高幅度明显高于二甲双胍和塞来昔布单药处理组。提示，二甲双胍联合塞来昔布可通过下调PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上调Bax表达发挥抗胃癌的作用。

综上所述，二甲双胍和COX-2选择性抑制剂塞来昔布可通过下调PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上调Bax表达这一相同的调控机制抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，促进细胞凋亡，两药联合应用可起到协同抗肿瘤的作用，二甲双胍和塞来昔布的联合用药有望成为治疗胃癌的新策略。