高危型HPV感染老年宫颈癌患者HPV水平与宫颈局部免疫功能的相关性

郑淑敏 章丽 (德州市人民医院妇产科，山东 德州 253000)

宫颈部疾病是妇科常见疾病之一，其中宫颈癌位居第二位，且近年来，其发病率呈不断上升趋势，严重威胁全球女性的生命安全，现阶段已成为公共卫生亟待解决的问题〔1〕。相关流行病学显示，宫颈癌的发病主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染、长期口服避孕药、性行为等因素有关〔2〕。HPV属于DNA病毒，对皮肤与黏膜上皮均会造成感染，主要依靠性行为传播，人类是其唯一宿主，高危型HPV感染常导致患者罹患宫颈癌的风险增加〔3〕。但是仅仅感染HPV，常不足以进展为宫颈癌，此外免疫性疾病、机体微环境改变等均是致癌因素〔4〕。体液免疫包括CD56+等，细胞免疫主要是由淋巴细胞介导，成熟的T淋巴细胞只表达CD4+与CD8+T淋巴细胞，其中CD4+淋巴细胞被活化后成为辅助性T细胞，CD8+淋巴细被活化后成为具有毒性的T细胞，对靶细胞具有特异性杀伤力〔5，6〕。故临床常用CD4+、CD8+、CD4+/CD8+来反映组织或协同局部细胞免疫情况。目前临床关于探究高危型HPV感染的宫颈癌患者体内HPV水平与局部免疫功能之间相关性的研究较少。本研究分析高危型HPV感染的老年宫颈癌患者HPV水平与宫颈局部免疫功能之间的相关性。

1 资料与方法

1.1纳入对象 本研究符合医学伦理委员会制定的相关审核标准，且均在获得患者及家属同意后翻阅患者病历资料。通过整群抽样法，回顾性分析山东省德州市人民医院2017年1月至2019年10月明确伴HPV感染的200例宫颈癌患者的临床资料，并将其纳入宫颈癌组，年龄60～78〔平均(69.85±7.23)〕岁；临床分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期78例，Ⅲ期56例，Ⅳ期33例；淋巴结转移78例，无淋巴结转移122例。将确诊为宫颈上皮内瘤变(CIN)的30例患者临床资料纳入内瘤变组，年龄60～76〔平均(68.98±6.99)〕岁；CIN分期：CINⅠ级7例，CINⅡ级13例，CIN Ⅲ级10例。另外纳入同时期内健康体检为慢性宫颈炎的30例志愿者，并将其纳入慢性宫颈炎组，年龄60～80〔平均(69.23±7.11)〕岁。上述3组受试者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，研究具有可比性。

1.2入选及排除标准 纳入标准：①除了慢性宫颈炎之外，其余患者经病理组织确诊，且已明确组织性质及临床分期与分级；②经荧光定量聚合酶链反应明确伴HPV感染；③受试者均有性生活史；④受试者临床资料完整。排除标准：①入组半年内伴局部或全身免疫增强剂治疗；②重要脏器功能受损严重者；③伴其他部位恶病质者；④两组或多重HPV感染；⑤采样前3 d内阴道未用药。

1.3采集样本 采用一次性无菌扩阴器撑开受试者阴道，使宫颈充分暴露，用棉签轻轻拭去宫颈处的分泌物。采用潮州凯普生物有限公司生产的HPV锥形宫颈刷，在宫颈口顺时针旋转5圈以上后取出，放置在专用细胞保存液的取样管中，折断刷柄，盖好管盖，并标记好受试者姓名、年龄等一般信息，避免混淆，在取样过程中注意保护受试者隐私，防止交叉感染，且所有受试者的样本取样由同一组妇产科医师完成。

1.4HPV-DNA检测方法 采用mRNA抽提与反转录试剂盒合成cDNA，利用聚合酶链反应扩增进行实时荧光定量检测步骤与方法严格遵循试剂盒说明进行。

1.5宫颈局部免疫指标水平检测 所有入组受试者于入院次日清晨，空腹状态下抽取3 ml肘静脉血，选用由美国BD Biosciences Accuri C6流式细胞检测仪，采用流式细胞术检测局部免疫指标水平。具体检测方法：将血标本置于4℃保存，并在1 h内进行检测，将淋巴细胞浓度调整至5×106/L利用台盼蓝进行染色，明确活细胞率>85%，取100 μl全血加入测定管中，并加入磷酸盐缓冲液稀释至200 μl，再加入流式细胞术专用抗体20 μl摇匀，避光保存在4℃冰箱内30 min，加入红细胞裂解液裂解。直至出现澄清液体，利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，再次加入0.1%的甲醛溶液固定细胞，2 h后上机检测。

1.6评价指标 比较3组受试者HPV及宫颈局部免疫功能各指标〔CD8+、调节性细胞(Treg)、CD4+、CD4+/CD8+、CD56+〕水平，并分析HPV水平与宫颈局部免疫功能各指标的相关性。

1.7统计学方法 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、χ2检验、双变量Pearson相关性检验。

2 结 果

2.1HPV阳性者宫颈局部组织免疫组化染色 见图1。

2.2各宫颈疾病患者HPV水平及免疫指标水平 HPV、CD8+、Treg水平宫颈癌组>CIN组>慢性宫颈炎组，CD4+、CD4+/CD8+、CD56+水平宫颈癌组

图1 HPV阳性宫颈局部组织免疫组化染色(DAB，×200)

表1 各组HPV水平及免疫指标水平比较

2.3HPV与各免疫指标之间的相关性 CD4+、CD4+/CD8+、CD56+与HPV之间呈负相关(r=-0.468，-0.252，-0.078，均P<0.001)；CD8+、Treg与HPV之间呈正相关(r=0.221，r=0.180，均P<0.001)。

3 讨 论

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，2016年全国肿瘤登记中心发表的相关数据显示，我国宫颈癌占女性特有恶性肿瘤第二位，且近年来，我国宫颈癌的患病率与死亡率呈逐年上升趋势〔7〕。目前诸多国家已将对适龄女性的宫颈癌筛查纳入国家医疗保障体系，但诸多发展中国家女性的宫颈癌癌前病变筛查并未能有效实施，导致罹患宫颈癌的女性患者仍较多，特别是老年人群，其机体各系统功能低下，机体防御能力较低，罹患宫颈癌的风险较其他人群高，故早发现、早治疗对宫颈癌的防治具有重要意义〔8，9〕。

本研究结果表明高危型HPV感染宫颈癌患者HPV水平呈高表达，且HPV水平与宫颈局部免疫功能指标之间关系密切。HPV是一种微小的DNA双链病毒，长约55 nm，含有8 000个碱基对，对皮肤及黏膜上皮均会造成严重感染，人类是HPV易感染宿主。HPV的致病机制主要表现在：①HPV-DNA整合、整合位点与宫颈癌之间的关系：宫颈肿瘤早期，HPV16、HPV18 DNA均整合到宿主细胞基因组中，伴随宫颈局部组织的不断进展，HPV-DNA整合入宿主的基因不断增多，而HPV-DNA的高度整合又负性促进宫颈病变的恶性程度，如此形成恶性循环，诱发病情不断加重〔10，11〕。②HPV E2破坏与宫颈癌之间的关系：E2蛋白是HPV基因组编码中具有特异性的DNA束缚蛋白，对病毒mRNA的转录及DNA赋值具有调控作用，对E6、E7的表达具有负性调节作用；此外，其还能够通过病毒启动周围的基因序列，进而对转录过程进行抑制，当E2遭到破坏时，其负反馈调节功能也随之消失，导致致癌基因E6、E7的高表达，进而导致机体组织发生癌变〔12，13〕。人群在感染HPV之后，通过启动免疫系统来对HPV感染进行有效清除，机体免疫系统主要包括固有免疫与适应性免疫，其中适应性免疫包括T细胞介导的细胞免疫与浆细胞抗体介导的体液免疫，其中细胞免疫在HPV拮抗方面具有重要意义〔14〕。由T淋巴细胞介导免疫细胞成熟状态下主要表现为CD8+与CD4+，其中CD4+负责启动免疫，CD8+执行免疫，被病毒感染的细胞能够被CD8+直接杀死；CD4+主要分为Th0、Th1、Th2亚型，Th0在抗原刺激下发育为Th1、Th2亚型，并分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4、白细胞介素-6等细胞因子，上述细胞因子均能够介导机体产生抗体，参与免疫反应；CD8+细胞在各细胞因子的作用下，释放穿孔素、颗粒酶等，对靶细胞起到杀伤作用〔15，16〕。CD56+主要存在脾脏、血液等部位，属于自然杀伤细胞的标志物，在没有致敏淋巴细胞与抗体作用下，CD56+即可对肿瘤靶细胞进行抑制、杀伤〔17〕。Treg在宫颈癌变过程中对免疫系统具有显著抑制作用，可帮助肿瘤靶细胞逃脱免疫系统监视而继续存活，导致机体内肿瘤细胞积聚，最终致病〔18〕。

综上所述，高危型HPV感染的老年宫颈癌患者HPV水平呈高表达，且HPV水平与宫颈局部免疫功能指标之间关系密切，临床可通过检测宫颈局部组织免疫指标水平情况，为高危型老年宫颈癌患者的早期诊断与预防提供科学依据。