黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达

章亭洲,王碧娇,林路成,徐志伟,陆梦甜,易蒲红,吴石金

(1.浙江科峰生物技术有限公司,浙江 海宁 314400;2.浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014)

β-1,4-D-甘露聚糖酶[β-1,4-D-mannan mannanohydrolase,EC 3.2.1.78],简称β-甘露聚糖酶(endo-1,4-β-mannanase),可以随机水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露吡喃糖苷键。β-甘露聚糖酶在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白及能源开发等领域和行业都得到应用,用途十分广泛。β-甘露聚糖酶在多种生物中均存在,包括动物、植物、微生物等,在不同物种中活性差别较大[1-3]。其中微生物来源的β-甘露聚糖酶不仅可以工业化发酵生产并高效分离纯化制备,还具有活性高、成本低等显著优点,已引起高度的关注和开发应用[4-7]。例如在饲料加工生产中,甘露聚糖等非淀粉多糖是一组不易被动物利用的碳水化合物。β-甘露聚糖酶具有一般非淀粉多糖酶类的作用,因此,可以作为一种新型的酶制剂应用于饲料原料加工,用于消除饲料中甘露聚糖等不容易降解的多糖类,可提高谷物、饼粕类原料的消化能,节约资源[8]。β-甘露聚糖酶还可以促进动物类胰岛素生长因子IGF-I的分泌,因此可以作为一种多功能的促生长剂,促进纤维素的消化、能量吸收和蛋白合成,提高瘦肉率[8]。此外,甘露聚糖分解后可以产生动物益生元功效物质甘露寡糖,不仅可以促进肠道内有益菌群的形成,还可以调节机体免疫系统,提高动物免疫力,从而降低发病率[9]。

甲醇营养型毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统具有表达效率高、外源基因遗传稳定和可高密度培养等优点,已成为优良的外源蛋白的真核表达宿主。酵母也是优良单细胞蛋白(Single cell protein,SCP)生产菌种,但是由于天然的酵母菌均缺乏水解β-1,4-D-甘露糖苷键的酶类,用于饲料原料等行业的底物加工时不能有效去除甘露聚糖等非淀粉多糖。因此,通过构建表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌,既可作为潜在的单细胞蛋白来源,又可进行工业化发酵生产甘露聚糖酶，应用于多种行业,充分发挥毕赤酵母可利用工业发酵罐水平进行大规模商业化生产并且能耗低、节约成本等优点,是一条极具潜力的途径,应用前景广阔[10]。20世纪90年代后期开始国外先后将不同来源的淀粉酶、木聚糖酶基因引入毕赤酵母进行表达,已成功构建能分解淀粉和木聚糖的酵母工程菌[10-12]。笔者构建了含黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的高效整合型表达载体,转化甲醇营养型毕赤酵母菌,获得能高效随机水解甘露聚糖分子主链中的β-1,4-D-甘露糖苷键的毕赤酵母基因工程菌,为后续工业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、培养基、酶和主要试剂

黑曲霉(Aspergillusniger)、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株和质粒酵母表达载体ppic9K由为笔者实验室保存;限制性内切酶、T4连接酶、Taq酶均购自TaKaRa公司;IPTG和蛋白质标准物购自上海生工;其他常规化学试剂为国产分析纯产品。

BMGY培养基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,无氨基酵母氮源YNB 13.4 g,甘油10 mL,0.1 mol/L pH 6.0磷酸缓冲液100 mL,加蒸馏水至1 L,调pH至 6.0,121 ℃灭菌20 min。

BMMY培养基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,YNB 13.4 g,甘油 10 mL,生物素0.04 mL,浓度0.1 mol/L pH 6.0磷酸缓冲液100 mL,加蒸馏水至1 L,调pH至6.0,121 ℃灭菌20 min,加过滤除菌甲醇5 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶克隆

根据GenBank中已登录的黑曲霉β-甘露聚糖酶基因序列预测氨基酸序列,设计并合成引物,正反引物两侧分别带有EcoR I和NotI酶切位点,反向引物引入6xHis标签序列。Trizol法提取黑曲霉总RNA,通过反转录PCR(RT-PCR)技术得到β-甘露聚糖酶基因cDNA,试剂盒纯化回收后与pMD18(Takara,大连生物工程公司)克隆载体16 ℃过夜连接,热激转化E.coliDH5α感受态细胞,在LB/Amp抗性平板上筛选阳性克隆。获得重组质粒并测序。β-甘露聚糖酶氨基酸序列为MSFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVD-LVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTV-WYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAE-QHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSG-ETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAV-FAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIK-GLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEG-LNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWG-NGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNHC-SVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLST-GKSPDGGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIDSA

1.2.2 重组表达载体的构建

从获得测序正确的pMD18-manA上用EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切获得甘露聚糖酶manA目标基因,同时用EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切毕赤酵母表达质粒pPIC9K获得大片段,胶回收目标基因和载体片段,16 ℃过夜连接,连接产物热激转化E.coliDH5α感受态细胞,在LB/Amp抗性平板上筛选阳性克隆。菌落PCR验证获得阳性克隆并测序。

1.2.3 重组表达载体LiAc法转入毕赤酵母

操作步骤:1) 挑取3～4 mm毕赤酵母单菌落接种于5 mL YPD液体培养基,30 ℃,250 r/min过夜培养;2) 以V(菌液)∶V(培养基)=1∶100接种到50 mL YPD液体培养基,30 ℃,250 r/min,培养至OD600至0.4～0.6;3) 于室温下5 000 r/min离心5 min,将收集的菌体用1倍TE缓冲液洗涤，8 000 r/min离心,将细胞重悬于2 mL Li-Ac/TE缓冲液中,于室温下放置30 min;4) 在EP管中混合新制备的酵母感受态细胞100 μL，10 μL carrierDNA，0.1～1.0 g pPIC9K/α-manA(用SacI线性化)和700 μL 40% PEG4000,于42 ℃热激7 min,转化后的酵母悬浮液离心并重新悬于200 μL1倍TE缓冲液中,取50 μL涂布于MD平板上,平板配置为琼脂糖20 g/L,YNB 13.4 g/L,葡萄糖20 g/L,生物素4×10-4g/L,G418 1.5 mg/L,于30 ℃下培养3～4 d。

1.2.4 毕赤酵母转化子的PCR鉴定与活性筛选

从目的基因序列两段设计引物进行PCR扩增验证,所用引物对为man-F:ACCGACAACGCTGATGTTGACTTGGTTAT,man-R:AACATGA-TCAGTAACCAAACACTGGTAGTC。挑取转化平板上的菌落溶于20 μL去离子水中,取10 μL用反复冻融法对酵母细胞进行破壁处理后,进行PCR扩增,反应体系为25 μL,包括上下游引物各1 μL,12.5 μL含酶混合液Mix,3.5 μL菌液,其余用水补足,以未转化的毕赤酵母鉴定作对照。扩增程序:95 ℃预变性5 min;然后以94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min进行30个循环;72 ℃终延伸10 min,4 ℃保存。反应完成后,取20 μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

用接种环挑取菌PCR结果正确的毕赤酵母转化子,提取重组质粒经大肠杆菌扩繁后送去测序。测序确认正确的毕赤酵母转甘露糖酶基因菌株进行酶活测定研究。

1.2.5 重组毕赤酵母的诱导表达、分离纯化与SDS-PAGE电泳

1) 诱导表达:将毕赤酵母工程菌在YPD平板上进行活化后,挑选单菌落接种到50 mL YPD液体培养基中,于30 ℃,200 r/min培养至对数生长期(OD600为3.0,约18 h)。以V(菌液)∶V(培养基)=1∶100量接种于50 mL BMGY液体培养基,继续培养24 h后离心收集菌体。将菌体用50 mL BMMY培养基稀释至OD600为1.0,加V(无水甲醇)∶V(培养基)=1∶100诱导表达144 h,离心,分别收集菌体和上清液进行蛋白分离纯化分析和酶活测定。

2) 分离纯化与SDS-PAGE电泳:采用Toyobo公司的His-tag蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白分离纯化。取20 μL含重组蛋白样品与5 μL 5倍上样缓冲液混合,缓冲液配置为Tirs-HCl 1 mol/L,pH 8.8,进行SDS-PAGE,蛋白胶用考马斯亮蓝G250染色。

1.2.6 重组β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌酶活检测

按照1.2.1～1.2.5方法进行诱导表达后进行工程菌酶活测定,对收集的细胞破碎后测定胞内酶活,对收集的胞外培养液进行胞外酶活测定。以2%可溶性魔芋精粉为底物,采用DNS法测定β-甘露聚糖酶的活性。取0.2 mL待测酶液,加入0.8 mL 2%可溶性魔芋精粉溶液作为反应底物,底物由pH 5.6的0.1 mol/L乙酸缓冲液配制,m(可溶性魔芋精粉)∶V(乙酸缓冲液)=2 g∶100 mL。70 ℃恒温水浴锅反应5 min,用0.5 mol/L NaOH溶液灭酶活。加入DNS试剂2 mL,沸水反应5 min后冷却定容至20 mL,测定波长540 nm处光度值。本实验条件下,定义每10 min产生1 mg还原糖的所需酶量定义为1个酶活单位(U)。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及检测

根据NCBI数据库中β-甘露聚糖酶基因的序列分析,manA的长度为1 149 bp,编码383个氨基酸的蛋白质,除去蛋白质N端38个氨基酸的信号肽后的序列进行毕赤酵母表达。提取黑曲霉总RNA后,通过RT-PCR扩增得到β-甘露聚糖酶的cDNA序列约1.1 kb,其结果如图1所示。PCR产物经纯化试剂盒纯化回收后,与克隆载体pMD18相连转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞,提取阳性克隆后,送至武汉生工公司测序。测序结果表明,与数据库发表的manA序列相似性为100%,证明已克隆得到黑曲霉β-甘露聚糖酶基因。

M—DNA分子量标准;1,2,3—3个平行反转录样本的PCR扩增片段。

2.2 酵母重组表达载体pPIC9K/α-manA的构建与鉴定

从pMD18-manA将目标基因切下并与毕赤酵母表达载体pPIC9K/α连接,转化大肠杆菌,进行菌落PCR验证。由于毕赤酵母表达载体pPIC9K自身带有胞外信号肽α因子,外源基因β-甘露聚糖酶manA克隆后形成N端融合有分泌信号肽序列的重组表达载体pPIC9K/α-manA,全长重组基因(信号肽α融合manA)为1 338 bp,菌落PCR产物长度和预期一致,如图2所示,表明酵母重组表达载体pPIC9K/α-manA构建成功。

M—DNA分子量标准;1,2—两个不同大肠杆菌菌落PCR扩增结果。

2.3 阳性克隆PCR与筛选结果

pPIC9K/α-manA通过热激法转入毕赤酵母菌株,β-甘露聚糖酶基因毕赤酵母转化子和菌落PCR筛选验证如图3所示。从转化平板上挑取转化子利用反复冻融法破壁后,进行菌落PCR鉴定,MD选择性培养基筛选如图3(a)所示。随机挑选了8个毕赤酵母转化子菌落,PCR扩增后3号菌落未扩增出目标片段,其余7个转化子均扩增出预期长度的目标片段,如图3(b)所示。用接种环挑取菌PCR结果正确的毕赤酵母转化子,提取重组质粒经大肠杆菌扩繁后进行测序确认,测序结果表明:β-甘露聚糖酶基因序列正确,β-甘露聚糖酶基因已成功克隆到毕赤酵母中。选择正确构建的转甘露糖酶基因毕赤酵母菌株进行酶活测定研究。

M—DNA分子量标准;1～8—不同菌落的PCR结果。

2.4 β-甘露聚糖酶基因的在工程菌中的表达

2.4.1 重组酶蛋白的SDS-PAGE检测

为了进一步检验毕赤酵母甘露聚糖酶重组工程菌中的重组酶蛋白的存在,毕赤酵母重组甘露聚糖酶工程菌经过培养,经甲醇诱导表达后,利用重组融合蛋白带有的His-tag标签进行亲和层析蛋白分离纯化,得到重组甘露聚糖酶蛋白,进行SDS-PAGE分析,得到了预期分子量附近的重组表达蛋白,其结果如图4所示。

M—分子量标准;1—工程菌胞外液分离纯化后的重组蛋白。

2.4.2 重组表达菌株酶活检测

分别挑取5株含重组表达载体pPIC9K/α-manA和1株含空载体pPIC9K/α的毕赤酵母进行培养,诱导表达后,收集菌体,检测重组菌胞内酶活和胞外酶活。由酶活检测结果可知:5株重组菌检测出β-甘露聚糖酶酶活,而对照空载体菌株没有检测到酶活,较高一株的酶活测定结果见表1。

表1 毕赤酵母重组菌和含空载体菌株的甘露聚糖酶活比较

2.5 讨 论

甘露聚糖是一种半纤维素类物质,存在于多种植物组织中,尤其是植物细胞的细胞壁及豆科等植物的种子中。麦类、豆粕、谷物等都是主要的食品和饲料加工原料,这些原料中含有大量的甘露聚糖。甘露聚糖是大分子物质,极易吸水,在单胃动物消化道内易形成凝胶状,阻碍营养物质与消化液的接触,从而影响消化吸收,降低动物的生产性能[8]。

β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-mannanase,EC 3.2.1.78)是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等以β-1,4-D-甘露吡喃糖为主链的甘露聚糖的内切水解酶。β-1,4-甘露聚糖酶已被广泛用于饲料、食品、医药、纺织印染、造纸、生物能源、生物基化学品和石油开采等诸多领域,进行甘露聚糖的分解[1-2]。甘露聚糖酶水解产物甘露低聚糖是功能性低聚糖,具有益生元的功效,可以促进人和动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖,改善肠道内菌群结构,还可以清除自由基、增强机体抗氧化能力[8-9]。我国是农业大国,富含甘露聚糖的相关原料资源非常丰富,但是附加值比较低,开发制备活性较高的甘露聚糖酶以及工业化处理和生产技术,可用于低聚甘露聚糖等高附加值产品生产,提高资源化利用水平。

微生物是β-1,4-甘露聚糖酶的重要来源,但是基于天然微生物进行的传统甘露聚糖酶生产方法具有产量低、酶比活低、生产成本高等缺点,不能满足工业化生产的需要和日益增长的市场需求[9,13-14]。因此,利用基因工程技术改造和构建甘露聚糖酶基因工程菌是一条极具潜力的途径,可以解决上述不足之处[15]。巴斯德毕赤酵母是一种真核生物,开发的表达系统具有表达量高、产物便于分离纯化、蛋白活性高等优点,已被广泛应用于外源酶的表达和生产[11,16-18]。

3 结 论

构建了毕赤酵母重组表达甘露聚糖酶的基因工程菌,通过α分泌肽进行N端融合成为重组酶,实现分泌表达。对工程菌进行β-甘露聚糖酶酶活测定后发现,最高胞外酶活为125.78 IU/mL,酶的比活力为188.86 U/mg。研究结果表明:β-甘露聚糖酶酶基因已在毕赤酵母中成功表达并能有效分泌到细胞外,从而使得下游的重组酶分离纯化、利用工程菌直接进行富含甘露聚糖底物的加工利用等更加简单一些,显著降低酶的制备和应用成本,为进一步工业化生产应用奠定了基础。