纤维素酶基因克隆与表达研究进展

徐俏冉 杨欣欣 张珊 王瑶 陈建军

【摘 要】纤维素是广泛存在于自然界的多糖类物质，纤维素酶能有效地将纤维素分解成单糖加以利用，其在能源、纺织、饲料、食品和造纸等行业具有重要的应用。

由于纤维素酶热稳定性较低、酶活力不高而不能满足生产需要，纤维素酶基因的克隆及表达日益被人们重视起来。结合纤维素酶在生产中的应用及市场化的需求，本文概括了近年来国内外对纤维素酶基因克隆与表达的研究进展。

【关键词】纤维素 纤维素酶 基因克隆 工程菌 表达载体

引言

纤维素在人们赖以生存的地球上无处不在，是人们可以利用的可再生资源，但纤维素本身是不可以直接被人们利用的，要先把它降解为可被人利用的物质。目前，在降解纤维素的多种方法中，生物法还是较为有效的[1]，它是利用微生物代谢的产物纤维素酶来降解和转化纤维素，但是在实际应用方面存在产酶活性较低、转化率不高、设备耗材超出预算等问题，因此构建出产酶量多，产酶活性高的纤维素酶基因工程菌对纤维素资源的有效利用和社会生产具有重要意义。近年来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，对纤维素酶基因的克隆及表达研究发展迅速，纤维素酶的应用已渗透到人们生产、生活的各个领域。

1 .纤维素

纤维素是一种多糖，它的化学简写分子式为（C6H10O5） n，它的热稳定性很好，在室温条件下，不易降解，不易分解，一般条件下，并不发生显著的变化[2]。以150℃为界限，温度高到一定程度时，也会发生化学反应。纤维素与无机酸，苛性碱溶液以及强氧化剂均可以发生化学反应[3]。

2 . 纤维素酶

2.1 纤维素酶的组成

纤维素酶由三部分组成，分别是：外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，它是靠这三种酶共同作用，来发挥自己的功效的[4]。纤维素酶的最适pH一般在4.5-6.5，过酸或者过碱都可以使酶失活。纤维素酶活力还算比较稳定，但是，目前人们发现了一些抑制剂，可以抑制酶的活力，比如铜离子和汞离子，而相对应的，还有些物质可以解除这种抑制，它就是半胱氨酸[5]，我们可以有效的利用它，来最大程度的发挥酶的活力。

2.2纤维素酶的来源

纤维素酶无处不在，真菌，细菌，放线菌中都有产纤维素酶的菌[6]。目前，报道过的产纤维素酶的菌株主要集中在真菌方面，如黑曲霉Aspergillus Niger、绿色木霉Green trichoderma viride、里氏木霉Magnitude of trichoderma viride、康氏木霉Kang Shimu mildew和嗜热毛壳菌 QM9381Bacteria QM9381， thermophilic MAO shells 等[7]；细菌中被发现的并不多，如芽孢杆菌Bacillus、瘤胃细菌Rumen bacteria（黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和热纤梭菌Thermal fiber clostridium等。

2.3 纤维素酶的作用机理

纤维素酶降解纤维素的过程中，首先纤维素酶要结合到底物上，形成酶-纤维素二元复合物，完成纤维素酶降解纤维素的第一步，即吸附[8]。由于吸附的条件不同，吸附的效果也不同。内切葡聚糖酶先发挥作用后，外切葡聚糖酶再发挥作用，β-葡萄糖苷酶与其二者协同作用，共同将纤维素分解为葡萄糖。内切葡聚糖酶先作用于微纤维的非结晶区，将其分解成大小不等的短链，外切葡聚糖酶作用于这些短链，生成纤维二糖，最后β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖等，生成葡萄糖。

2.4 纤维素酶的应用

纤维素酶在食品发酵工业、动物饲料行业、纺织和造纸行业中都有广泛的应用，在石油勘探、中药成分的提取等领域中也有所涉及。在酒精生产中，添加纤维素酶不仅可以提高啤酒的纯度和啤酒生产的速度，而且可以保证啤酒的质量及提高啤酒的口感[9]。在饲料中，添加纤维素酶不仅可以促进消化，还有利于提高家畜的体重[10]。在纺织行业中，采用纤维素酶对织物进行洗涤时，其可以对纤维表层进行有效的控制，从而使织物均匀褪色[11]。

3 .纤维素酶基因克隆及表达的研究

随着分子生物学、遗传工程的迅猛发展，国内外均在尝试应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌，而且对特殊环境中的纤维素酶产生菌也产生了浓厚的兴趣。这些菌具有独特的酶学性质，扩大了纤维素酶的应用范围[12]。

在20 世纪70 年代，纤维素酶基因的克隆开始兴起并蓬勃发展起来。到目前为止，人们克隆到纤维素酶的基因并不是单一的，在成千上万个物种中都有发现与收获，其中在细菌和真菌中尤其广泛[13]。同时，克隆到的酶基因能否成功的表达也十分重要，已有文献证明纤维素酶在大肠杆菌中表达是比较普遍而且高效的[14]，另外，人们还在逐步寻找其他的表达载体。但是与国外相比，国内对纤维素酶的研究还很缓慢，很多菌株因为产酶能力低或者热稳定性差而不能被很好的应用。

如今，很多学者已克隆出不少的纤维素酶基因，而且其中一大部分都在大肠杆菌中进行了表达[15]。

宁玉洁等[16]从约氏梭菌属CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C，大小为1943 bp，编码647个氨基酸，将该基因构建于大肠杆菌表达载体pET28a（+）中，获得重组表达载体pET28a-Cel9C，转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中进行表达。

Kim等[17]将耐热菌Aqu ifex aeolicus VF5中编码耐热内切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆并且转导入大肠杆菌XL1-Blue中，通过表达和检测，发现内切葡聚糖酶在80℃时酶活最大。

李春华等[18]以CpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1， 4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625中，最后通过平板检测及SDS-PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达。

虽然纤维素酶克隆与表达的研究在现阶段已经取得了很大的进展，但表达、分泌均较弱，并没有在真正意义上得到高效分解纤维素的工程菌，不能大规模的应用于生产[19]。由此观之，虽然纤维素酶具有广阔的应用前景和良好的发展前途，但人们对纤维素的世界了解的还不够深入透彻，有很多未知的领域等待我们探索和突破，另外，纤维素酶还有良好的商业价值，人们在生产的各个领域，如果能使纤维素酶发挥出应有的功效，那将是酶工程的一项重大突破[20]。

4 . 展望

迄今为止，很多纤维素的潜在资源没有被人们利用，既造成了环境污染，也浪费了资源，并对物质资源造成了很大的压力[21]。有研究报道显示，我国是农业大国，很多玉米等谷物的麦秆都被焚烧，世界的麦秆每年产量约40亿吨，光被我国燃烧掉的就占了八分之一，如果我们可以把这些资源利用起来，变废为宝，不仅可以缓解环境的压力，也可以很好的解决资源浪费的问题。很多发达国家的纤维素的利用率比我国高出了五分之一，所以，我们应该学习他们的先进技术，努力构建高产纤维素酶的基因工程菌，并把它用于生产实践，解决我国纤维素资源浪费的问题。相信在不久的将来，纤维素酶会在我们生活的各个领域发展壮大，将会给人们带来巨大的经济效益，会给商品化社会带来推动作用，会更加便于人类的生活。

参考文献：

[1]Sanjeev K Sharma，Krishan L Kalra，Harmeet S Grewal.Enzymatic saccharification of pretreated sunflower stalks[J].Biomass and Bioenergy，2002，23：237 -243.

[2]陈冠军，杜宗军，高培基.耐碱性真菌纤维素酶生产菌的筛选及酶学性质的初步研究[J].工业微生物，2000，30（4）：23.

[3]刘海燕，白龙，赵海波，等.纤维素酶高产菌的筛选鉴定及纤维素酶基因的克隆与表达[J]. 中国农业大学学报，2012，17（5）：92-98.

[4]Chen，H.Z.，Li，X.L.，&Ljungdahl;，L.G.（1997）. Journal of bacteriology， 179，6028-6034.

[5]Michel，G.Chantalat，L.，Duee，E.，Barbeyron，T.，Henrissat，B.，Kloareg，B.，et al.（2001）.Structure，9，513-525.

[6]Hahn，M.，Olsen，O.，Politz，O.，Borriss，R.，&Heinemann;，U.（1995）.The Journal of biological chemistry，270，3081-3088.

[7]孟雷，陈冠军，王怡，等.纤维素酶的多型性[J].纤维素科学与技术，2002，10（2）：47-55

[8]R. Kumar， C. E. Wyman. Does change in accessibility with conversion depend on both the substrate and pretreatment technology？ Bioresource Technology， 2009， 100： 4193-4202.

[9]刘春芬，贺稚非，蒲海燕，等.纤维素酶及应用现状[J].粮食与油脂，2004，1：15-17.

[10]赵荣乐.纤维素酶研究进展[J].喀什师范学院学报，2005，26（6）：51-54.

[11]刘雨田，郭中文.β-葡聚糖与β-葡聚糖酶[J].畜禽业.2000，第7期：42-43. [49] 施永泰，朱墓元.大麦β-葡聚糖酶的研究和展望[J].大麦科学.2001，第1期：5-8.

[12]肖春玲.微生物纤维素酶的应用研究微生物学杂志[J].微生物学杂志，2002，20（3）：10.

[13]杨志愿，邱业先，李孝坤，等.几株反硝化聚磷菌的筛选及其生理生化特性的鉴定[J].环境科技，2009，26（3）：42-48.

[14]倪浩.黑曲霉内、外切葡聚糖酶基因的克隆与表达[D].南京林业大学，2010.

[15]Viggo Lindahl， Kari Aa， Arne Tronsmo. Nucleotide sequence of an endo-β-1，4-glucanase gene from Bacillus subtilis CK-2[J].Antonie van Leeuwenhoek， 1994，66（4）： 327-332

[16]宁玉洁，闯绍闯，陈晓林，等.纤维素降解菌中葡聚糖酶基因的克隆表达及活性[J].安徽农业大学学报，2015，42（6）：910-914.

[17]Kim JO， Park SR， Lim WJ， et al. Cloning and characterization of thermostable endoglucanase（Cel8Y）from the hypert thermophilic Aquifex aeolicus VF5[J]. Biophysical Research Communications， 2000， 279（2）：420-426.

[18]李春华，廖贵芹，张桂敏，等.β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].湖北大学学报（自然科学报），2005，27（3）：275-279

[19]夏黎明，萧庆，余世袁.碳源对固定化里氏木霉合成纤维素酶的影响[J].纤维素科学与技术，1994，2（3-4）：72-77

[20]张伟，龚月生，杨明明.耐热纤维素酶产生菌的筛选与酶基因的克隆及表达[D].西北农林科技大学硕士论文，2012.

[21]Mrkbak AL， Degn P， Zimmermann W. Deinking of soy bean oil based inkprinted paperwith lipases and a neutral surfactant[J].J.Biotechnol.，1999，67（2-3）：229

通讯作者：陈建军