严重急性呼吸综合征冠状病毒2型4种结构蛋白特性分析

（吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062）

2019新型冠状病毒病（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2）引起的一种主要通过近距离空气、飞沫传播和密切接触传播的呼吸道传染病[1]，目前在世界范围内广泛传播，并已造成世界范围的大流行。截至北京时间2020年5月15日2时31分，全球累计确诊人数已达4 386 761人，累计死亡人数已达297 043人[2]，并且仍在增加。该病毒属于基因组最大的一类RNA病毒，容易发生变异，这给疾病的诊断、预防和治疗都带来了较大困难。

人感染SARS-CoV-2后的常见体征有发烧、乏力，部分出现干咳，少数有流鼻涕、鼻塞以及胃肠道症状[3]，严重的可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡[1]。报道[1，4]显示：该病毒在人群中传染性明显增加，致死率为2%～4%，虽然比普通流感高，但远比严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、埃博拉病毒和H7N9流感病毒低；该病的中位潜伏期只有3 d，长的可达24 d以上，且在家庭和社区有明显的聚集发病现象。

与SARS-CoV相同，SARS-CoV-2含有单股正链RNA基因组，具有5'帽子（cap）和3' poly（A）尾巴的结构，长度在29.5～30.3 kb之间[5-6]。基因组由11个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成，分别编码ORF1ab，刺突蛋白（spike protein，S），ORF3a，囊膜蛋白（envelope，E），膜蛋白（membrane protein，M），ORF6，ORF7a，ORF7b，ORF8，核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）和ORF10[6-8]。序列同源性分析发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV的核酸序列约有80%的相似性[9]，而与蝙蝠源冠状病毒RaTG13（GenBank号 MN996532）的全基因组同源性达93.7%～96.2%，其ORF1ab、N和S蛋白的氨基酸同源性分别为98.5%、99.05%和97.41%[10]。

研究表明，冠状病毒的刺突蛋白（S），囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）对病毒感染有重要作用。它们的主要功能是入侵宿主细胞，维持病毒粒子形态，帮助病毒粒子装配、释放，其中S、M、E 3种蛋白位于病毒囊膜表面[11]，而N蛋白则位于病毒囊膜内侧。

以往的SARS-CoV研究发现：在感染过程中，S蛋白与宿主表面受体血管紧张素转化酶2（angiotensin I converting enzyme 2，ACE2）结合[12]，并经过网格蛋白和小窝蛋白非依赖型内吞途径进入细胞[13]，然后将病毒基因组释放到宿主细胞质中。而在病毒组装过程中，M蛋白的C端和核衣壳相互作用形成一个核心结构，S蛋白则与病毒囊膜合为一体，然后再与M、E蛋白相互作用，从而完成病毒粒子装配，然后成熟的病毒粒子穿膜释放到胞外[14-15]。因此，M和E蛋白可能与S蛋白在病毒包膜形成过程中起共同作用[15-17]。也有研究[17-21]推测，E蛋白与病毒传染性有关。

目前研究[22]显示，SARS-CoV-2的S蛋白结构与SRAS-CoV非常相似，同样可与ACE2结合，并且靶向SARS-CoV S蛋白的中和抗体也可与SARS-CoV-2相结合[22]。因此，S蛋白受体结合域也是相关抗体、疫苗研发的重要靶点。

N蛋白最重要的功能是识别病毒基因组RNA的特征序列，与病毒基因组RNA结合形成螺旋状的核衣壳，并与其他结构蛋白相互作用，完成病毒粒子装配[9，11，15]。此外，N蛋白也可能与病毒RNA合成[23]以及病毒建立感染有关[24-25]。

众所周知，蛋白质的功能与其结构密切相关。本研究借助生物信息学蛋白分析工具，分析SARSCoV-2的4个结构蛋白的分子生物学特征，并预测4种蛋白的部分结构域，以期为更好地了解该病毒，并为SARS-CoV-2的相关分子生物学研究和针对其结构蛋白的疫苗开发等提供参考，也为后期的COVID-19防治奠定基础。

1 材料和方法

选取NCBI上公布的SARS-CoV-2的4种结构蛋白序列进行特性分析，其中S蛋白为YP_009724390，M蛋白为YP_009724393，E蛋白为YP_009724392，N蛋白为YP_009724397。

1.1 氨基酸组成分析

应用DNAstar软件的子程序Protean，分析蛋白的氨基酸组成。

1.2 信号肽预测

应用SignalP-5.0[26]在线服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/），预测4种蛋白各自的信号肽及其剪切位点。

1.3 亚细胞定位预测

用在线服务器PSORT Prediction（http://psort1.hgc.jp/form.html），对4种蛋白进行亚细胞定位。

1.4 跨膜结构预测

使 用TMHHM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0），预测4种蛋白的跨膜结构。

1.5 BUSCA综合分析

使用BUSCA在线服务器（http://busca.biocomp.unibo.it/），综合分析、预测4种蛋白的信号肽、跨膜区和亚细胞定位。

1.6 B细胞抗原表位预测

应用ABCpred[27]在线服务器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html），直接预测S蛋白的B细胞抗原表位；应用DNAstar软件的子程序Protean，采用Kyte-Doolittle[28]方法，预测4种蛋白的亲水性；用Karplus-Schultz[29]方法，预测4种蛋白的可变性；用Emini[30]方法，预测4种蛋白的表面可及性；用Jameson-Wolf[31]方法，预测抗原指数。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成分析

应用DNAstar软件的子程序Protean，对蛋白的氨基酸组成进行分析发现，E蛋白的核酸序列含有228 nt（nucleotide），编码75个氨基酸。该蛋白相对分子质量为8 365.06 Da，等电点为8.33。在构成E蛋白的氨基酸中，亮氨酸（Leu）占比最高，达到18.67%；而天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）占比最低，仅为1.33%。此外，E蛋白不含组氨酸、色氨酸和谷氨酰胺。

M蛋白的核酸序列含有669 nt，编码222个氨基酸。该蛋白相对分子质量为25 146.68 Da，等电点为9.48。在构成M蛋白的氨基酸中，Leu占比最高，达到 15.77%；而半胱氨酸（Cys）、Met和Gln占比最低，仅为1.8%。

S蛋白的核酸序列为3 822 nt，编码1 273个氨基酸。该蛋白相对分子质量为141 178.84 Da，等电点为6.47。在构成S蛋白的氨基酸中，Leu占比最高，达到8.48%；而Trp占比最低，仅为0.94%。

N蛋白的核酸序列有1 260 nt，编码419个氨基酸。N蛋白相对分子质量为45 625.69 Da，等电点为10.10。在构成N蛋白的氨基酸中，甘氨酸（Gly）占比最高，达到8.48%；而组氨酸（His）占比最低，仅为0.95%。此外，N蛋白不含Cys。

2.2 信号肽预测

经SignalP 5.0预测，N、M和E 3种蛋白N端存在信号肽的可能性极小。而S蛋白在N端存在信号肽，且有96.89%的可能性属于常规分泌（Sec/secretory）通路，由I型信号肽酶（SPase I，SPI）进行切除。信号肽剪切位点有53.53%的可能性在15～16 aa（SQC-VN）处（图1）。

2.3 亚细胞定位

用PSORT Prediction预测，发现N蛋白存在于细胞核内的可能性最大（表1），而S蛋白最可能存在于质膜，可能性为46.0%，其次是微体（表2）。

E、M蛋白最可能定位于质膜和内质网膜上，但M蛋白也有46.0%的可能性存在于高尔基体（表3～4）。

图1 S蛋白信号肽预测结果

表1 N蛋白亚细胞定位预测结果

表2 S蛋白亚细胞定位预测结果

表3 E蛋白亚细胞定位预测结果

表4 M蛋白亚细胞定位预测结果

2.4 跨膜结构预测

使用TMHHM 2.0预测4种蛋白的跨膜结构发现：E蛋白1～11 aa在膜内，35～75 aa在膜外，12～34 aa为跨膜区（图2-A）；M蛋白40～50、101～222 aa在膜内，1～19、74～77 aa在膜外，20～39、51～73、78～100 aa为跨膜区（图2-B）；S蛋白1～1 213 aa在膜外，1 237～1 273 aa在膜内，1 214～1 236 aa为跨膜区（图2-C）；N蛋白则全部处于膜外，无跨膜区（图2-D）。

图2 S、E、M、N蛋白的跨膜结构预测结果

2.5 BUSCA预测

使用BUSCA在线服务器，对4种蛋白进行综合分析预测，发现结果与前面的预测基本相符，表明E、M、S蛋白均定位于质膜上，N蛋白定位于胞质内，但E、M蛋白也有可能定位于内质网膜。E蛋白9～42 aa为α螺旋跨膜区，M蛋白14～36、42～68、75～101 aa为α螺旋跨膜区，S蛋白1～21 aa为信号肽区段，1 051～1 062、1 213～1 234 aa为α螺旋跨膜区。

2.6 B细胞抗原表位预测

根据之前的分析，E、M蛋白多为α螺旋跨膜，N蛋白无跨膜结构域，因此选择S蛋白预测其抗原表位。由于抗原决定簇区域通常具有较好的亲水性、表面可及性和柔性，因此本研究使用DNAstar子程序Protean，对S蛋白的亲水性、柔性、表面可及性和抗原指数进行分析，选择这4种方法预测结果中共有的区段作为潜在的B细胞抗原表位，结果发现S蛋白的抗原位点较可能在20～29、75～81、95～98、111～116、148～152、181～186、458～466、575～581、676～685、773～779、809～815、1071～1 076、1 141～1 145、1 147～1 156、1 158～1 165、1182～1 187、1 204～1 208、1 258～1 262 aa处（图3）。

图3 Protean预测S蛋白抗原表位结果

而ABCpred则给出较多抗原表位预测结果，且表位主要集中在S蛋白序列的中间区域。将Protean和ABCpred预测的结果进行对比，筛选出共有抗原表位在25～29、75～81、112～116、148～152、773～779 aa。

3 讨论

关于SRAS-CoV-2的生物学和流行病学等特性仍存在许多未知。目前，对SARS-CoV-2结构蛋白的研究也大多集中在S蛋白的受体结合域（RBD）[32]、抗原表位[33-34]和疫苗设计[32]等方面，而对E、M、N蛋白结构的研究却较少，因此本研究对S、E、M、N蛋白的结构域进行多种分析。而鉴于它们的二级结构特征，本研究使用不同的方法[27，29-31，35]预测S蛋白B细胞抗原位点，并给出共有抗原表位。

表5 ABCpred预测S蛋白抗原表位得分高于0.85的结果

本研究对不同的结构域预测使用了不同的方法。BUSCA得到的复合结果与之前使用SignalP、PSORT prediction和TMHHM得到的结果基本一致，均提示S蛋白N端存在信号肽，S、E、M蛋白存在跨膜结构域，N蛋白无跨膜结构域。这与报道的冠状病毒4种结构蛋白各自的分布及功能相符[9，11-12，24，36]。而在抗原表位预测中，基于S蛋白序列特征，预测出抗原表位25～29、75～81、112～116、148～152、773～779 aa更可能是潜在的抗体靶标。这一结果与之前报道的潜在抗原表位有所一致[34]。

本研究通过对SARS-CoV-2的4种结构蛋白结构特征进行分析，进一步了解了4种蛋白的结构域特征，也为下一步的分子生物学和实验动物学研究提示了方向。在后期工作中，将在目前研究基础上，分析该病毒结构蛋白特征，并寻找可能的药物靶点，合成抗体肽，进行更多分子生物学和医学学科的交叉研究，希望能为解析该病毒的感染和致病机制以及为相关药物设计、临床治疗提供参考。同时本研究采用的思路和方法对于研究其他病毒的结构蛋白，以及针对其蛋白设计相应的抗体、药物等也会有一定的参考价值。