一起鹦鹉多重混合感染的诊治

（青岛农业大学，山东青岛 266109）

鹦鹉喙羽病是由喙羽病病毒（psittacine beak and feather disease virus，PBFDV）引起的一种常见的鹦鹉传染病，患病鹦鹉羽毛、喙部变形，胸腺及法氏囊结构异常，通常造成幼雏死亡[1]，可垂直传播；按病程长短可分为急性型、慢性型和亚临床型，急性型常发生于幼雏，患病鹦鹉突然死亡[2]，慢性型和亚临床型常发生于成年鹦鹉，导致羽毛、喙和爪子畸形[3]。喙羽病于20世纪70年代在澳大利亚首次被发现，之后随着活禽贸易而蔓延至全球[4]。PBFDV属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员，为单链环形DNA病毒[5]，基因组大小为2 000 bp，编码复制相关蛋白（replication-associated protein，Rep）和衣壳蛋白（capsid protein，Cap）2 个主要蛋白[2，5]。电镜观察病毒呈14～16 nm无包膜二十面体[6]。鹦鹉幼雏病（budgerigar fledgling disease，BFD）是由禽多瘤病毒（avian polyomavirus，APV）引起的急性传染病，是目前对鹦鹉危害最为严重的传染病之一[7]，3周龄以下的鹦鹉雏鸟易感，表现为羽毛发育迟缓、消瘦、腹部肿胀和神经症状等，致死率极高。BFD于1980年初首先在美国被发现，随后在澳大利亚、日本、意大利、匈牙利、斯洛伐克和德国等被陆续报道，现已蔓延至世界各地[8]。我国于1994年首次在湖北省发现该病，并确认该病由APV引起[9]。APV为乳多空病毒科（Polyomaviridae）多瘤病毒属（Polyomavirus）成员，为无囊膜、环形双链 DNA[10]，基因组大小为4 981 bp，编码Large T、Small t、VP1、VP2、VP3、VP4 和 VP4 Delta 等7种蛋白[11]。

鹦鹉作为一种观赏鸟类，越来越受人们的喜爱，因而鹦鹉养殖业随之兴起。随着鹦鹉养殖业的扩大和进口量的增加，疾病也越来越多。PBFDV和APV是感染鹦鹉的常见病毒，严重危害鹦鹉的健康，对鹦鹉养殖业带来巨大影响，导致严重经济损失。2019年12月山东省青岛市某虎皮鹦鹉养殖场2～3周龄幼鸟出现腹泻、脱水、腹部肿大，嗉囊饱满，排白绿色粪便，粪便糊肛，发育迟缓等临床症状，大量鹦鹉幼雏死亡，死亡率达到80%。成鸟无死亡，无明显发病症状，产蛋正常。该场鹦鹉未接种过任何疫苗，发病后曾用恩诺沙星、土霉素、双黄连等药物进行治疗。本研究对该养殖场的患病幼鸟进行了临床诊断，使用PCR方法进行了相关病毒检测，无菌采集发病幼鸟组织进行细菌分离鉴定等细菌学检测，确诊为PBFDV、APV及链球菌混合感染，并提出相应的治疗措施。

1 材料与方法

1.1 病理剖检及病料采集

对送检的死亡和发病的10～15日龄的虎皮鹦鹉幼鸟进行病理剖检观察，无菌采集发病鹦鹉的肝脏、肺脏及心包积液进行病原检测。

1.2 实验室检测及药敏试验

1.2.1 主要试剂 TSA、TSB培养基及革兰氏染色液，均购自青岛海博生物有限公司；MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒，购于宝日医生物技术有限公司（TaKaRa）；一步法PCR试剂盒（Dye Plus），购自诺唯赞生物科技有限公司；禽腺病毒及鹦鹉热衣原体荧光定量PCR试剂盒，购自青岛巴特菲生物科技有限公司；细菌核酸提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2.2 PCR检测 根据参考文献合成PBFDV、APV、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）引物，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成（表1）。无菌采集适量发病鹦鹉的肝、肺组织研磨后取上清，使用病毒核酸提取试剂盒提取上清液中的病毒核酸（DNA/RNA）采用普通PCR方法检测PBFDV、APV、NDV及AIV用荧光定量试剂盒检测禽腺病毒和衣原体。

表1 PCR检测引物

1.2.3 细菌分离鉴定 无菌采集鹦鹉肝脏及心包积液，划线接种于TSA培养基及血琼脂培养基上，37 ℃恒温培养18 h。挑取单个纯菌落，进行革兰氏染色镜检。取分离得到的单个菌落接种到肉汤试管中培养增菌，过夜培养菌液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，利用通用引物[15]扩增细菌16S rDNA，PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，所得序列进行BLAST比对分析。

1.2.4 药敏试验 操作程序参考李桂喜等[16]试验方法。采用纸片琼脂扩散法对分离得到的菌株进行阿莫西林克拉维酸、强力霉素、头孢他啶、头孢曲松、妥布霉素、大观霉素、庆大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、环丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲恶唑等药物的药敏试验，用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据美国NCCLS药敏试验标准判定药物的敏感性。

2 结果

2.1 临床病理剖检

剖检发现：肝脏表面有大小不等的黄白色坏死灶，呈大理石样外观（图1-A）；心包积液，心肌出血；腹腔积液呈黄色，有胶冻样渗出（图1-B）；十二指肠出血（图1-C），肌胃出血；肺出血，气管环出血（图1-D），输尿管有白色尿酸盐沉积，脾脏肿大。

图1 病理剖检结果

2.2 实验室检测

2.2.1 PCR检测 对提取的核酸进行PCR、RTPCR以及荧光定量PCR扩增，结果NDV、AIV、禽腺病毒、衣原体均为阴性。PBFDV、APV的PCR扩增目的条带与预期大小一致，分别为495 bp、318 bp，PBFDV在肝组织检测为阳性，肺组织为阴性；APV在肝、肺组织均检测为阳性（图2）。

图2 PCR检测结果

2.2.2 细菌分离鉴定 TSA培养基上出现半透明、圆形、表面光滑、整齐的菌落（图3-A），血琼脂平板上出现不同程度的溶血（图3-B），革兰氏染色阳性，呈单个或双链排列，有些呈短链状排列（图3-C）。对提取的细菌核酸进行PCR扩增，得到长度为1 428 bp的目的条带（图4），与预期片段大小相符。PCR产物测序结果经BLAST比对分析确定该分离菌株为链球菌。

图3 细菌分离鉴定结果

图4 16sDNA PCR检测结果

2.2.3 药敏试验 药敏试验结果（表2）显示，该分离菌对阿莫西林克拉维酸高度敏感，强力霉素中度敏感，而对头孢他啶、头孢曲松、妥布霉素、大观霉素、庆大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、环丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲恶唑不敏感。

表2 药敏试验结果

3 防治

PBFDV和BFD目前尚无有效的治疗药物和疫苗。根据药敏试验结果对链球菌进行抗菌治疗，建议该场鹦鹉使用阿莫西林克拉维酸饮水5 d。同时建议鹦鹉养殖场的主人做好，严格消毒；保持鸟舍良好的环境卫生和丰富的营养饲料，饲料或饮水中加入适量的维生素、微量元素等营养成分，以提高免疫力。及时淘汰病鸟，防止疾病的传播和蔓延。场长反馈用药5 d后死亡率有所下降。

4 讨论

PBFD和BFD是鹦鹉的常见传染病，在鹦鹉养殖中较为多发，危害严重，对幼雏影响较大，致死率较高，成年鹦鹉无明显的临床症状，这为养殖场的疾病预防工作造成了极大影响。本研究针对青岛市某鹦鹉养殖场的发病情况进行了相关病毒PCR检测，结果显示PBFDV和APV呈阳性，排除了流感病毒、新城疫病毒、腺病毒以及衣原体的感染，并分离鉴定出链球菌，确诊该病例为PBFDV、APV及链球菌混合感染。PBFDV和APV感染鹦鹉的研究早已被多次报道，曾有研究者证明，1994年BFD在我国已经开始传播，并证明病原为APV[9]。APV引起BFD的病例被发现的时间较早，但始终没有引起人们重视。PBFD于20世纪70年代在澳大利亚首次被发现，之后随着活禽贸易而蔓延至全球[4]。蒋文明等[12]在2009年首次报道了PBFDV在我国大陆地区鹦鹉种群的传播，后PBFDV也陆续在我国养殖场中检出，但始终没有引起人们的重视。Fogell等[17]在8个没有报道过PBFDV的国家中检测出PBFDV，表明该病毒的分布比目前所掌握的更广泛。有研究发现，活禽贸易是PBFDV传播的重要方式[18]。因此，需要加强鹦鹉疾病的检测与防控工作，以及进口鹦鹉的防疫检测，建立合理有效的鹦鹉病检疫程序，以保证鹦鹉养殖业的平稳发展。PBFDV和APV混合感染的情况比较多见，而且PBFD和BFD症状相似，在诊断时要做到准确诊断，做好鉴别区分，如1998年Ramis等[19]首次在鹦鹉养殖舍中发现PBFDV和APV的混合感染，吴汝娟等[20]对青岛市的发病鹦鹉进行PCR检测，发现存在PBFDV和APV的双重感染。在疾病过程中常常继发细菌感染，因此对致病菌的检测必不可少。本研究在患病鹦鹉的肝脏组织中分离鉴定出链球菌。链球菌为条件性致病菌，通常在一定诱因的作用下才会发病。本研究推断，该养殖场发病的原因可能是由于冬季温度降低，舍内通风不良，导致PBFD、BFD及链球菌的混合感染。药敏试验结果显示，该菌对阿莫西林克拉维酸高度敏感，而对头孢他啶等多种药物均耐药，所以临床使用抗生素一定要选用敏感药物，切忌乱用药，以免造成更大的损失。

近年来，我国引进大量鹦鹉，造成外来鹦鹉疾病的传播，但对于鹦鹉疾病的研究却很少。由于对疾病的认识不足以及不够重视，导致许多疾病的防疫工作难以进行，治疗也无计可施。希望本研究能引起广大鹦鹉养殖户的重视，也为PBFD和PFD的防治提供一定的参考。