云南省边境地区送检牛血清样品蓝舌病病毒抗体检测与血清型鉴定

2020-10-10

中国动物检疫 2020年10期

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

蓝舌病（bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的，通过媒介昆虫库蠓传播的虫媒病毒病[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其归为一类动物疫病。该病主要发生在热带、亚热带地区，近年来有北移趋势，主要引起绵羊、牛等反刍动物发病，尚无有效的治疗方法[2]。目前全球已报道27种BTV血清型，我国分离到BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、14、15、16、21、24等13种血清型[3-10]。不同血清型毒株在同一区域同时流行时，容易发生基因重组，且不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给BT防控带来了严峻挑战[11-12]。

云南省地处我国西南边陲，有5个州市25个县（市）与缅甸、老挝和越南交界，有11个国家级口岸、9个省级口岸及数百条边境通道，边境线长4 060 km，是我国通往东南亚、南亚的关口。近年来，由于国内肉类价格持续增高，每年有大量牛等活动物通过边境线进入我国境内，使云南省边境地区BT防控形势更为严峻。为掌握云南省边境地区BT流行情况，本研究采用BTV C-ELISA抗体检测试剂盒和微量血清中和试验方法，对2019年云南省边境5个州市12个县（市）送检的1 580份牛血清样品进行了BTV检测和血清分型，以期为我国BT防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 血清样品

牛血清样品来自云南省边境地区5个州市12个边境县（市），其中德宏州（芒市、瑞丽市）365份，西双版纳州（景洪市、勐海县、勐腊县）649份，文山州（富宁县）31份，普洱市（孟连县、西盟县、江城县）255份，临沧市（沧源县、镇康县、耿马县）280份，均由所在县（市）的动物疫病预防控制中心送检。

1.2 主要仪器和试剂

Multiskan FC酶标仪，购自Thermo公司；脱脂奶粉，购自BD difco公司；BTV C-ELISA检测试剂盒、PBSTM（磷酸盐缓冲液+Tween 20+脱脂奶粉），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；BTV 24个型的参考病毒，由本实验室保存；Corning Incorporated 96孔细胞培养板、PBS干粉、Tween 20，均购自云南丰科生物科技有限公司。

1.3 血清抗体检测

按照BTV C-ELISA试剂盒说明书，对待检血清进行检测，读取OD450值，计算血清样品抑制率，判定血清是否为阳性[13]。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔OD450≤0.2，两孔间OD450差值＜0.05，两个阴性对照孔1.0≤OD450＜1.6，两孔间OD450差值＜0.2。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照OD450平均值-样品血清OD450值）/阴性对照OD450平均值×100%；抑制率≥50%，判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异存在统计学意义。

1.5 血清型鉴定

从C-ELISA检出的BTV阳性血清样品中，每县（市）随机挑选15～55份进行微量血清中和试验；按Karber方法计算24个血清型标准毒株的半数感染量（TCID50）；参照GB/T18636—2017[14]中的方法，将24个BTV标准毒株与BTV抗体阳性血清进行中和试验，确定BTV血清型。

2 结果与分析

2.1 抗体检测

2.1.1 地区分布从各县（市）送检的1 580份牛血清样品中，均检测到BTV抗体阳性血清（表1），共检出阳性血清1 155份，抗体阳性率为73.1%，表明牛BTV感染在云南省边境地区普遍存在。各县（市）BTV抗体阳性率有所差异，其中芒市最高（94.1%），沧源县最低（17.0%）。各州市BTV总阳性率比较结果显示：临沧市最低（43.6%），与其他州市差异均显著（P＜0.05）；西双版纳州与德宏州比较，差异存在统计学意义（P＜0.05）。

2.1.2 群间分布本地牛和入境牛BTV血清抗体统计结果（表2）显示：本地牛和入境牛血清BTV抗体阳性率差异不大（P＞0.05），分别为74.1%和72.9%。

表1 云南边境地区牛BTV血清抗体检测结果统计

表2 本地牛和入境牛BTV血清抗体统计

2.2 血清型鉴定

2.2.1 BTV血清型分布对随机选取的541份BTV抗体阳性血清样品进行血清微量中和试验检测。结果（表3）显示：共鉴定出17种血清型，数量在100份以上的依次是BTV-1、16、3、5、21、15。各县（市）均存在5个以上血清型分布，其中：景洪市最多，有14个，沧源县最少，有5个，其他县（市）在6～11个之间。各州（市）优势血清型并不相同，德宏州2个市均存在BTV-3、5、15、16、17、18、21、24型8个血清型；西双版纳州1市2县均存在BTV-1、13、16、21、24型5个血清型感染，普洱市3县均存在BTV-4型，临沧市3县均存在BTV-3、5、21型3个血清型。

表3 各县（市）牛BTV阳性血清中和抗体检测结果

2.2.2 BTV血清型混合统计对各县（市）存在的16个BTV血清型进行混合感染统计的结果（表4）显示：在541份血清型定型样品中，存在77种两种血清型混合感染，其中BTV-3型与BTV-5型混合感染样品数量最多，有18份，占定型样品总数的3.3%；其次是BTV-16型与BTV-21型混合感染，有15份，占定型样品总数的2.8%，BTV-3型与BTV-16型、BTV-5型与BTV-16型混合感染均有14份，占定型样品总数的2.6%。

3 讨论

虫媒病毒病防制极为困难，全球每年因BTV感染而导致的经济损失高达30亿美元[15]。我国对BT等动物虫媒病的研究相对滞后。1979年张念祖等[15]首次在云南省师宗县发现BTV，此后湖北（1983）、安徽（1985）、四川（1988）等省份分别报道发现BTV。2017年血清学和病原学流行病学调查发现，我国11个省份63个市区检测到BTV抗体阳性[16-20]。BTV可能会因库蠓移动传播、新血清型传入和致病性增强等引起牛群大规模发病，影响牛产业健康发展及相关畜产品贸易[21]，因此加强BTV血清学调查对该病的预防与控制极为重要。

本次检测在云南省边境地区5个州市12个县（市）的送检牛血清样品中均检测到BTV抗体，表明BTV在云南边境地区流行广泛。本研究的云南省12个边境县（市）均位于热带或者亚热带地区，与越南、老挝、缅甸接壤，年均气温较高、日照时间较长、降雨量较多，适于各类库蠓生长和繁殖，有利于BTV传播。由于本次检测样品数量有限，且均为送检样品，检出结果可能不能真实反映该地流行情况，但对于了解BTV在该地的流行状况和特点具有参考意义。来源地为本地和境外的牛血清样品间抗体阳性率差异不显著（P＞0.05），说明云南边境地区BTV流行态势与缅甸、老挝、越南类似，这可能与云南边境地区气候环境、传播媒介等与上述三个国家类似有关。