脂肪积聚肝恶性转化模型制备及其生物信息学分析*

王 理 ，潘文洁，刘 莹，顾娟娟，叶文欣，杨 婕，姚 敏***

(南通大学1 医学院信息学系，2 智能信息技术研究中心，3 南通先进通信技术研究院，南通 226001；4 南通大学医学院免疫学系；5 南通大学附属医院临床医学研究中心；6 江苏省海门市人民医院肿瘤科；7 南通大学生命科学院)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已是最常见的慢性肝病之一[1-2]，成为除慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝癌病毒(hepatitis C virus,HCV)感染之外，与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生密切相关的最主要的病原学因素[3-4]。NAFLD是一种临床病理综合征，肝组织伴有弥漫性脂肪变性和脂质积聚，其机制复杂涉及胰岛素抵抗、线粒体氧化功能异常、铁超载、信号通路等，尚未完全清楚。近年，有关NAFLD的研究进展，非编码RNA调控及线粒体内膜肉毒碱棕榈酰转移酶-Ⅱ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ,CPT-Ⅱ)失活等[5]被发现，然而脂肪变性肝细胞恶性转化与肝癌发生关系仍倍受关注[6]。本文以脂肪积聚诱发肝细胞发生恶性转化模型，以生物信息学技术分析基因表达谱、生物过程(biological process,BP)、信号通路等改变，观察了甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)、CD44和Wnt3a等肿瘤相关标志的动态变化。

1 材料与方法

1.1 脂肪肝模型方法 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由南通大学实验动物中心提供，5周龄、体质量(110±10)g共60只，按研究设计随机分为对照(normal control,NC)组(n=12)、NAFLD组(n=12)和脂肪肝诱癌组(n=36,6只/组×6)，于(22±2) ℃、12 h光/暗周期和湿度55%的环境中饲养。NC组以普通饲料喂养；NAFLD组以高脂饲料(10%蛋黄粉，10%猪油，4%胆固醇1%胆酸和普通饲料75%)喂养；脂肪肝诱癌组在NAFLD组的基础上，继续以高脂饲料加化学致癌物2-乙酰氨基芴(2-fluorenylacetamide,2-FAA)(0.05%,Sigma,USA)颗粒饲料喂养。每2周随机取2只对照鼠、2只高脂鼠和一组脂肪肝诱癌鼠，乙醚麻醉，经腹心脏采血5 mL，分离血清置-20 ℃保存；手术开腹腔摘取肝组织，部分于液氮速冻后放-80 ℃冰箱保存。实验通过南通大学动物实验伦理审查(2018-0228-001)。

1.2 肝病理组织学检查 肝组织以病理学苏木精-伊红(Hematoxylin & Eosin,HE)染色法检查：鼠肝组织经10%(V/V)中性甲醇溶液固定后，以梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，于切片机上切片，温水烫平贴到载玻片上，恒温烘干。以二甲苯脱蜡，苏木精溶液染色，水洗后在70%和90%乙醇中依次脱色，伊红染色。经无水乙醇脱水、二甲苯透明，滴树胶，盖玻片封固。在OLYMPUS BX51光镜下观察、摄片。

1.3 油红O染色 每组切片行油红O染色，按试剂使用说明书(南京建成公司)操作，在OLYMPUS IX71光镜下进行观察、摄片。通过Image Pro Plus 6.0软件图像分析系统，测定每个视野的红色区域的面积与该视野总面积比，以代表每个肝组织脂肪的相对含量，进行图像分析半定量研究。

1.4 基因芯片制备与RNA提取 肝组织100 mg加1 mL TRI reagent置冰上匀浆后，加200 μL氯仿混匀，以12 000 g，4 ℃离心15 min。吸上层透明水层，移到无菌离心管。加500 μL异丙醇混匀，以12 000 g，4 ℃离心10 min。除上清液加1 mL 80%乙醇混匀。以7 600 g，4 ℃离心5 min。移除乙醇，室温5 min，以无RNase水30 μL溶解，RNA定量，以Affymetrix Phalanx表达谱芯片(v2版)，在安捷伦RNA 6000 nano assay检测(上海仪方生物技术有限公司)，以基因表达信号比(signal logarithm ratio,SLR)表示各基因上调或下调。

1.5 RNA样品放大与荧光标定反应 使用OneArray plus RNA amplification kit(华联公司)。以T7 Oligo引子产生cDNA，加RNase及DNA聚合酶合成第二股cDNA；以T7启动子行反义RNA合成，加aa-UTP形成aa-aRNA，再加NHS-CyeDye。NHS与Amino Allyl反应，使aa-aRNA变成CyeDye-aRNA完成标定；纯化后与Phalanx OneArray TM杂交，经清洗及讯号侦测后分析。在Agilent Microarray Scanner(G2505C)扫描，PMT100%与10%于10 μm分辨率行2次扫描。再用GenePixTM4行影像数据撷取，获2份初级数据格式gpr档案，最后用华联芯片内之控制探针行2份gpr数据讯号强度转换，并整合成1份gpr数据文件进行后续数据分析。

1.6 生物信息学分析 用Rosetta Resolver R System(Rosetta Biosoftware)进行数据前处理(含数据筛选、校正)与统计计算，按差异表达基因筛选阈值为|log2倍数|≥1且P＜0.05来筛选差异基因，在R3.0.3版本环境下以amap、ctc和gplots等package进行聚类分析，最后将筛选出来的差异基因进行基本信息注释Gene Ontology分析、Pathway分析并对资料进行归纳、整理和分析。

1.7 差异表达基因互作网络分析 将筛选的差异表达基因上传DAVID生物信息学数据库行基因本体论(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，找差异表达基因分子功能、细胞组成、生物过程和富集KEGG信号通路。

2 结果

2.1 脂肪肝模型组织病理学及肝脂肪染色 60份肝组织按病理组织学检查(HE染色)分为5组：NC组(n＝12,图1A)，镜下肝细胞以肝小叶中央静脉为中心呈索状排列的，细胞边界清楚，胞核大而圆，核内染色质稀疏，染色较浅，肝小叶及汇管区无炎性细胞浸润(图1A1)，未见脂肪积聚(图1A2)；NAFLD组(n＝12,图1B)，镜下肝细胞索排列不清，细胞体积增大、肿胀，核深染，胞浆中出现大小不等脂肪空泡(图1B1)，将胞核挤向一侧，肝小叶及汇管区见少量炎性细胞浸润，细胞中脂肪堆积明显(图1B2)；肝细胞变性(hepatocyte degeneration,H-deg)组(n＝14)，镜下肝细胞索排列紊乱、边界不清，肝小叶及汇管区炎性细胞浸润明显，核清晰，少量异型性，核周围许多小空炮并融合为大空泡，轻度肝纤维化，脂肪染色明显；癌前(precanceraion,Pre-c)组(n＝12)，镜下见肝假小叶形成，炎性细胞浸润，核深染、多核，不典型增生，纤维化明显和脂肪着色；癌变(liver cancer,LC)组(n＝10)，镜下肝组织中肿瘤细胞呈巢状排列，大小不一，边界模糊，核圆深染且多核和明显脂肪着色。肝细胞恶性转化不同阶段的脂肪经油红O染色，通过Image-Pro-Plus软件定量分析，结果显示与NC组鼠肝比较，NAFLD组脂肪含量升高9倍(t＝14.781,P＜0.001)、H-deg组2.4倍(t＝5.962,P＜0.001)、Pre-c组2.3倍(t＝8.375,P＜0.001)和LC组8倍(t＝11.976,P＜0.001)，肝细胞脂肪积聚明显。

2.2 肝脂肪积聚与相关基因表达谱分析 脂肪肝恶性转化过程中血脂与肝酶学异常。NAFLD组、Hdeg组、Pre-c组和LC组血清总胆固醇(2～3倍)，三酰甘油浓度(1.5～4.5倍)明显高于NC组，诱癌后Hdeg、Pre-c和LC过程中伴肝细胞损伤，丙氨酸转移酶及门冬氨酸转移酶活性为NC组的4～8倍。由NC、NAFLD、脂肪肝诱癌后出现H-deg、Pre-c和LC鼠肝组织的全基因表达谱散点图(图2)可见，LC组与NC组差异基因的对比变化最明显，显示在脂肪肝进展的不同阶段，均有多基因参与肝细胞的恶性转化。

2.3 差异基因的聚类分析 基因表达谱分析显示，与NC组肝组织(log2比率≥1.0和P＜0.05；2倍为-1.0≤log2比率≥1.0)比较，NAFLD组、H-deg组、Pre-c组和LC组肝组织中上调基因分别有70、609、1 015和1 234个，下调基因分别为93、325、437和504个，总共有4 287个差异表达基因。其中，差异表达基因在LC组vs NC组变化最为显著，共筛选出1 738个。NAFLD组vs NC组差异表达基因上调和下调前30个差异基因表达聚类分析见表1。

2.4 GO功能富集分析 差异基因分别进行GO分析，包含BP，细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)信息。BP主要富集于胆固醇、脂质的合成及代谢、氧化还原等；与NC组比较，H-deg组富集在有丝分裂M期、细胞周期、细胞分裂、固醇合成等过程；Pre-c组富集在固醇合成、有丝分裂M期、细胞周期、细胞分裂等过程；LC组富集在内源性刺激、甾体激素、激素刺激的反应，固醇、羧酸及有机酸等生物合成过程。CC主要富集于细胞的组分、核膜、内质网、内质网膜等；H-deg组富集在染色体着丝粒区、微管细胞骨架、纺锤体及细胞外等组分；Pre-c组集中在微管细胞骨架、染色体着丝粒区、质膜、细胞外及纺锤体等组分；LC组富集于细胞外部分、微管细胞骨架、质膜、细胞外基质等组分。MF主要富集于氧化还原酶及酸巯基酶活性，肽抗原、铁离子、辅因子结合等功能；与NC组比较，Hdeg组富集在蛋白二聚体、蛋白同源二聚体及氧化还原酶活性，同种蛋白、铁离子、维生素结合等功能；Pre-c组集中在生长因子、钙依赖性磷脂、同种蛋白及胰岛素样生长因子结合，氧化还原酶及酸巯基酶活性；LC组富集于有机酸钠转运体、微管运动、蛋白二聚活性，同种蛋白、钙离子、细胞骨架蛋白结合等功能。

表1 NAFLD组vs NC组差异表达基因中上调和下调的前30个差异基因表达聚类分析

2.5 KEGG通路分析 应用KEGG数据库对各组差异表达基因进行分析，对它们在生物体内各信号转导通路中的富集度进行查找分析显示：与NC组相比，NAFLD组差异基因主要富集于脂质合成相关通路(类固醇生物合成、萜类骨架生物合成及非饱和脂肪酸生物合成)以及免疫系统相关通路(产生IgA肠免疫网络、抗原提呈、移植物抗宿主病等)，见表2；H-deg组主要富集于脂质合成相关(类固醇生物合成、非饱和脂肪酸生物合成、PPAR通路)、氨基酸代谢相关(谷胱甘肽代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢)及细胞周期及肿瘤相关(P53通路、细胞周期)通路；Pre-c组富集于脂质合成的类固醇生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体通路、花生四烯酸代谢、谷胱甘肽和氮代谢及细胞周期及肿瘤相关(P53通路、细胞周期、小细胞肺癌及黑素瘤)通路；LC组富集于脂质合成[类固醇生物合成过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)通路]相关、细胞黏附、氨基酸代谢及细胞周期及肿瘤相关P53通路。可见脂肪肝恶化转化中差异基因众多，信号通路主要有固醇合成、P53、细胞周期信号通路，其中固醇合成通路Cyp51，Tm7sf2显著下调，Ccnb1和周期蛋白依赖性激酶1 (cyclin-depen dent kinases 1,CDK1)与P53通路和细胞周期相关，在蛋白相互作用中处关键位置。

2.6 脂肪肝恶性转化相关标志物 在脂肪积聚状态下，观察肝细胞发生恶性转化过程中部分常用肝癌标志物在基因转录水平上动态变化(图3)，结果显示：与NC组比较，GPC-3基因在H-deg组(t=3.151,P=0.010)、Pre-c组(t=5.098,P<0.001)和LC组(t=2.66,P=0.024)中明显上调(图3A)；AFP基因表达，在Pre-c组(t=4.051,P=0.003)和LC组(t=2.836,P=0.021)中显著上调(图3B)；CD44基因表达，在H-deg组(t=-5.364,P<0.001)、Pre-c组(t=4.399,P=0.002)和LC组(t=2.706,P=0.039)中明显升高(图3C)；Wnt3a基因表达，在Hdeg组(t=7.221,P<0.001)、Pre-c组(t=6.472,P<0.001)和LC组(t=6.809,P<0.001)显著上调(图3D)。显示在肝脂肪积聚状态下，相关癌胚型标志物随脂肪肝恶性转化严重程度增加而呈显著上调表达。

表2 NAFLD组vs NC组差异基因富集分析的主要KEGG通路

3 讨论

HCC危险因素包括NAFLD，它是肝细胞过量脂质蓄积，有关学说或机制众多，如胰岛素抵抗、脂质过氧化、细胞因子过表达、脂质代谢紊乱和铁超载等，除此遗传、环境、免疫和药物等对NAFLD均有影响，可促使NAFLD发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至HCC[2,6]。本研究通过基因表达谱芯片和生物信息学技术，分析脂质积累诱导肝细胞恶性转化过程中起关键作用的基因及相关分子的所在信号通路，为探讨肝细胞发生脂质积累状态下发生恶性转化分析机制，为肝癌早期诊断、个性化治疗和预后预测奠定基础。

脂肪积聚肝恶性转化分子机制尚不清楚。以高脂饮食和2-FAA建立脂肪肝恶性转化的动态模型，从基因表达谱获得差异表达基因甚多，NAFLD组数百个，H-deg、Pre-c和LC阶段差异数以千计；上调基因中获多个与线粒体及氧化呼吸链相关的基因。活性氧过量致氧化应激反应，造成细胞损伤，病理机制如磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)下游丝氨酸-苏氨酸激酶Akt/蛋白激酶B磷酸化，在细胞凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢和氧化应激抗性等方面有重要作用，且与PI3K-Akt通路联系紧密。线粒体内膜CPT-Ⅱ通过阻断体内脂肪酸的β 氧化，CPT-Ⅱ含量减少造成恶性循环[7]，肝脂质积累加重损伤肝细胞。筛选出关键基因和富集信号均与细胞氧化应激相关，氧化损伤细胞及DNA增多超过细胞修复后发生基因突变，进而致其恶性转化，参与癌变发生过程。

肝细胞恶性转化相关通路主要有Wnt、血管内皮生长因子、丝裂原活化蛋白激酶、Janus蛋白酪氨酸激酶、PI3K/丝氨酸-苏氨酸激酶Akt等，通过表达谱芯片数据筛选出脂肪积聚状态下与肝细胞恶性转化相关通路，包括类固醇生物合成和细胞周期及P53通路，新发现Cyp51和Tm7sf2、Ccnb1和CDK1在相互作用网络中均处关键位置与恶性转化相关：如Cyp51编码细胞色素P450与HCV所致肝癌有关[8]，其与NAFLD相关肝癌尚未发现；Tm7sf2基因缺乏导致核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)上调。由Tm7sf2编码蛋白存在于内质网，缺乏损害内质网功能；Tm7sf2缺失致三酰甘油积聚持续脂肪变性[9]，G1/S期延迟，降低细胞分裂，致P53改变诱导p21表达Ccnb1与肿瘤相关[10]；CDK1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，细胞有丝分裂及增殖关键蛋白，为抗肿瘤药物靶点[11]。

恶性转化相关部分差异表达基因如模型筛选出标志GPC-3、AFP、CD44和Wnt3a异常上调[12]；癌胚型GPC-3位于Wnt/β-catenin通路上游，可激活Wnt3a等下游信号分子，促进细胞发生恶性转化生长或肿瘤细胞生长；CD44属于干性信号分子，它的激活可促进肝细胞转化，且可介导细胞与基质、细胞与细胞间黏附促进肿瘤转移；提示脂肪肝恶性转化中，肝癌相关分子标志无论在mRNA还是蛋白水平均显著升高，可在肝细胞癌前病变阶段早期监测或诊断肝癌。

总之，本文制备NAFLD模型并和诱导肝细胞恶性转化，观察基因表达谱动态变化。从NAFLD到Hdeg、Pre-c和LC的发展过程中，差异基因众多，生物学过程集中在肝细胞对刺激反应的代谢调节，类固醇合成、P53、细胞周期等信号通路与脂肪肝恶性转化密切相关，新发现Cyp51、Tm7sf2、Ccnb1和CDK1为关键基因，癌胚型标志可早期监测脂肪肝的恶性转化，为寻找理想标志及NAFLD防治，提供了有用生物学信息。