Caspase-3抑制剂对顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用*

王 锋，陆 欢，范亚平，杨 斌，施 辉

(南通大学附属医院肾内科，南通 226001)

国内外对急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的研究集中在缺血再灌注、中毒、脓毒血症3个方面。随着大量新型药物如抗肿瘤药物、抗生素、造影剂等的应用，药物引起的AKI呈逐渐上升趋势。顺铂是

一种细胞增殖抑制剂，广泛用于实体肿瘤的治疗。顺铂的抗肿瘤效率好，但同时具有明显的剂量依赖性肾毒性，有效缓解顺铂的肾毒性可提高肿瘤患者的化疗质量。通过减少caspase-3的表达以达到对AKI的保护作用，在缺血再灌注模型中已经得到验证[1]，但对顺铂所致AKI的研究，国内鲜见。本研究通过探讨caspase-3抑制剂对顺铂诱导的正常大鼠肾小管上皮细胞(normal rat kidney tubular epithelial cell,NRK-52E)损伤的影响及其可能的作用机制，为临床缓解顺铂肾毒性提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 NRK-52E细胞(南京医科大学附属第二医院肾内科惠赠)；顺铂注射液(江苏豪森药业集团有限公司)；caspase-3抑制剂、青链霉素溶液、磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline,PBS)(碧云天生物有限公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(美国THERMO公司)；Annexin V-异硫氰酸酯(fluoresceine isothiocyanate,FITC)细胞凋亡检测试剂盒、细胞冻存液(凯基生物有限公司)；Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)-F12培养基(美国HYCLONE公司)；小牛血清(德国Capricorn Scientific公司)。

1.2 实验分组 (1)对照组(12、24 h)：NRK-52E细胞单独培养；(2)顺铂组(12、24 h)：①5 μmol/L顺铂亚组；②10 μmol/L顺铂亚组；③20 μmol/L顺铂亚组；(3)干预组-1(12、24 h)：①10 μmol/L caspase-3抑制剂+5 μmol/L顺铂亚组；②10 μmol/L caspase-3抑制剂+10 μmol/L顺铂亚组；③10 μmol/L caspase-3抑制剂+20 μmol/L顺铂亚组。(4)干预组-2(12、24 h)：①20 μmol/L caspase-3抑制剂+5 μmol/L顺铂亚组；②20 μmol/L caspase-3抑制剂+10 μmol/L顺铂亚组；③20 μmol/L caspase-3抑制剂+20 μmol/L顺铂亚组。

1.3 顺铂注射液及caspase-3抑制剂作用过程NRK-52E细胞常规复苏后用含10%小牛血清、1%青链霉素溶液的DMEM-F12完全培养液5 mL于25 cm透气瓶37 ℃、5%CO2温箱中培养，经2～3 d传代，培养至80%以上后，用0.25%胰酶(含EDTA)进行消化并传代培养。传至第3代，将NRK-52E细胞以5×105/孔浓度接种于6孔板，每孔加完培至2.5 mL总溶液。对照组(12、24 h)；顺铂组(12、24 h)各3个亚组；干预组-1(12、24 h)各3个亚组；干预组-2(12、24 h)各3个亚组。每个亚组各设3个复孔。

各组NRK-52E细胞相同条件下培养至贴壁60%，细胞形态良好；按等量替代原则，在顺铂组(24 h)3个亚组分别加入用PBS稀释后质量浓度为50 mg/μL的顺铂溶液75、150、300 μL；同时，在干预组-1(24 h)3个亚组先后加入2.5 μL caspase-3抑制剂(10 mmol/L)与相应质量浓度的顺铂溶液；干预组-2(24 h)3个亚组先后加入5 μL caspase-3抑制剂(10 mmol/L)与相应质量浓度的顺铂溶液。12 h后用相同的方法在12 h各组中加相应的顺铂及caspase-3抑制剂。所有试剂加入完毕后，各组最后共同培养12 h开始上机检测。

1.4 流式细胞术检测NRK-52E细胞的早凋亡率用Annexin V-FITC-碘化丙啶(propidium iodide,PI)法检测各组NRK-52E细胞凋亡情况。每孔去上清后用0.5 mL不含EDTA的0.25%胰酶消化收集各组细胞，显微镜下观察消化过程，待贴壁细胞脱落后每孔用1 mL完培终止消化，将每孔细胞溶液(1 000 r/min离心5 min)收集于3 mL离心管，用PBS洗涤细胞2次(1 000 r/min离心5 min)收集2.5×105个细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞后，先加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL PI，混匀；室温、避光反应15 min；流式细胞仪检测细胞早凋亡率。

1.5 统计学方法 每个实验步骤至少重复3次，各组取3复孔，均获得一致结果。各次实验的最终结果以表示，用SPSS 22.0进行t检验或单因素方差分析(One-way ANOVA，LSD法)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两空白对照组(12、24 h)比较差异无统计学意义(P＞0.05)；24 h组普遍比12 h组晚凋亡率高(图1～2)。未进行任何干预的对照组早凋亡率最低，顺铂诱导后的NRK-52E细胞早凋亡率较对照组明显升高，NRK-52E细胞早凋亡率与顺铂浓度呈正相关。Caspase-3抑制剂预处理组NRK-52E细胞凋亡程度较顺铂组轻(P＜0.01)；且20 μmol/L的caspase-3抑制剂比10 μmol/L的caspase-3抑制剂对减轻顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡作用更佳。24 h 10 μmol/L caspase-3干预组中，顺铂20 μmol/L和顺铂10 μmol/L组早凋亡率差异无统计学意义；且24 h 20 μmol/L caspase-3干预组中，顺铂20 μmol/L和顺铂10 μmol/L组早凋亡率差异亦无统计学意义(表1)。

表1 各组细胞凋亡率比较 %

3 讨论

顺铂的肾损伤机制牵涉多因素的共同作用：顺铂可通过对肾小管、肾血管的直接毒性作用，改变肾血流量和肾小球滤过率；顺铂可诱导肾间质炎症反应以及肾间质纤维化；顺铂可通过各种细胞通路、细胞因子、信号分子的传递引起肾脏的炎症、凋亡和坏死，从而直接损伤肾小管上皮细胞[2]。顺铂对肾脏的损伤具有剂量依赖性，如何最大程度地减少其肾毒性，达到顺铂对肿瘤患者最大治疗效应，成为目前治疗难点。研究[3-5]表明，抗氧化剂及许多巯基配体如Dendropanax morbifera、SRT1720、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、4-亚甲蓝基安息香酸、金属硫蛋白等对顺铂所致肾毒性具有一定保护作用，但是否有其他药物具有相似的作用，亦是目前研究热点。

Caspase家族在经典凋亡中具有重要作用，最后的凋亡过程通过caspase激活实现，caspase-3是最终的效应因子，在细胞凋亡蛋白酶级联反应中不可或缺，能裂解许多凋亡程序中级联蛋白酶催化反应中的蛋白，是凋亡途径中的关键酶和执行者。近年来研究[6]发现，caspase-3除与心血管疾病、肿瘤、神经退行性病变等发生有关外，通过抑制caspase-3的表达对缺血再灌注AKI亦有保护作用[7]，但其抑制剂直接作用顺铂所致AKI的研究目前国内外鲜有报道。

本研究结果显示顺铂诱导后的NRK-52E细胞早凋亡率较对照组明显升高，NRK-52E细胞早凋亡率与顺铂浓度呈正相关，验证了顺铂肾毒性的剂量依赖性。Caspase-3抑制剂预处理组NRK-52E细胞凋亡程度较顺铂组轻，且20 μmol/L浓度的caspase-3抑制剂比10 μmol/L浓度的caspase-3抑制剂对减轻顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡作用更佳，说明caspase-3抑制剂通过抑制caspase-3干预细胞凋亡从而对顺铂所致AKI具有保护作用，且与浓度呈正比。24 h后比较10 μmol/L caspase-3干预组和20 μmol/L caspase-3干预组：顺铂20 μmol/L和顺铂10 μmol/L组差异性不大，上述情况考虑可能和顺铂及caspase-3共同干预时间有关，说明caspase-3抑制剂对减轻顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡作用具有时效性。

综上所述，caspase-3抑制剂在体外实验验证其对顺铂所致AKI的保护作用，为临床AKI的治疗提供新的思路，但如何应用于临床，仍需进一步研究。