HDACs在斑马鱼视网膜再生中的作用研究*

陆 颖，陈 琪，张书强，胡 楠 ，徐 绘***

(1 南通大学教育部和江苏省神经再生重点实验室，神经再生协同创新中心，南通 226001；2 南通大学附属医院眼科；3南通大学生命科学学院，海洋学院)

作为视觉系统的核心部位，视网膜负责接收光信号并将其转化为电冲动传递给视神经。视网膜属于中枢神经系统，哺乳动物在因疾病或外伤导致的视网膜损伤后，缺乏有效的再生能力[1-2]。与哺乳动物不同，脊椎动物模式生物斑马鱼具有强劲的视网膜再生能力[3]。斑马鱼的视网膜再生依赖于视网膜内的神经胶质细胞-Müller细胞(Müller glia,MG)[4]。视网膜损伤后，MG迅速去分化并增殖产生Müller细胞来源的祖细胞(Müller glia-derived progenitors,MGPCs)[5]，后者进一步增殖并分化成各类型的视网膜神经元，最终修复视网膜并恢复大部分视力[6-8]。尽管对于斑马鱼的视网膜再生已有不少研究[9]，然而表观遗传学特别是组蛋白修饰在MG介导的视网膜再生中的作用仍不甚明了。本课题对组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)在斑马鱼视网膜针刺损伤模型中的表达和功能进行研究，揭示其在视网膜再生中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年野生型(AB)和转基因型斑马鱼TG(1016tuba1a:GFP)[10]由南通大学实验动物中心提供。斑马鱼相关实验的伦理审批由南通大学实验动物中心批准(批准号：20170320-017)。斑马鱼养殖条件为室温28 ℃，14 h黑夜/10 h白天，无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)系统水。实验用鱼仅使用1次，且给予正常进食及光照。

1.2 方法

1.2.1 视网膜RNA提取、逆转录和定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR) 视网膜总RNA提取参照TRIzol试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)说明书进行。RNA逆转录和qPCR参照课题组之前报道的实验方法[11]进行。

1.2.2 视网膜针刺损伤和冰冻切片 斑马鱼视网膜针刺损伤的方法参照课题组之前的研究[12]。在预定时间点麻醉斑马鱼并收取眼球，取眼球前3 h腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)以标记视网膜内增殖的MG和MGPCs。取好的眼球于4% 多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)中室温固定2 h，20%蔗糖处理6 h，并转移至O.C.T中包埋、冰冻切片，切片厚度为12 μm。

1.2.3 曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丙戊酸(valproic acid,VPA)处理 TSA和VPA均购自美国Sigma公司，配置成1 mmol/L的贮存液保存。视网膜损伤后，利用1 mL注射器将稀释成不同浓度的TSA(200 μmol/L)和VPA(5 μmol/L)行腹腔注射，1次/d，至实验取材。

1.2.4 免疫荧光染色 冰冻切片的免疫荧光染色方法参照Z.Q.ZHANG等[12]的研究方法。一抗：兔抗GFP(绿色荧光蛋白，1∶1 000，美国Thermo Fisher Scientific公司)，大鼠抗BrdU(1∶500，美国Abcam公司)，兔抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA，1∶500，美国GeneTex公司)。

1.2.5 BrdU标记和MGPC谱系追踪 BrdU标记增殖MG和MGPCs及MGPCs的谱系追踪方法参考Z.Q.ZHANG等[12]的研究。为标记正在增殖的MG和MGPCs，斑马鱼在取材前3 h腹腔注射20 μL 20 mmol/L的BrdU溶液。谱系追踪实验中，斑马鱼在损伤后2 d(2 dpi)接受1次BrdU腹腔注射(20 μL,20 mmol/L BrdU)以标记增殖的MGPCs，然后在第4天(4 dpi)取材。

1.2.6 统计学方法 所有实验均重复3次以上。实验数据以平均值±标准误表示。使用统计软件SPSS 11.0进行分析，均值比较采用t检验(双尾)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜针刺损伤后HDACs的表达模式 为了解HDACs在斑马鱼视网膜针刺损伤后的表达模式，在损伤后不同时间点(0 d未损伤对照、12 h、1 d、2 d、4 d和7 d)收取视网膜，提取总RNA，逆转录后进行qPCR检测HDAC家族基因的mRNA表达水平。qPCR结果显示，几乎全部hdac的表达在损伤后12 h均显著下调(图1)。根据12 h后的表达模式，这些基因可分为3类：第一类在1～2 d时恢复至损伤前水平，之后再次下调或维持不变，包括hdac1、hdac6、hdac8、hdac10和hdac12(图1)；第二类在1～2 d时表达显著升高，包括hdac3、hdac4、hdac5和hdac7a(图1)；第三类在1 d后仍维持下调，未能恢复至损伤前水平，包括hdac7b和hdac11(图1)。HDACs在损伤后的动态变化提示它们可能在视网膜再生中发挥重要作用。

2.2 视网膜再生中MGPCs的形成需要HDACs已有研究[13-14]证实斑马鱼视网膜损伤后4 dpi内核层(inner nuclear layers,INL)中BrdU+的细胞是多能性的MGPCs。为进一步研究HDACs在视网膜再生中的功能，利用HDACs的抑制剂TSA和VPA来抑制HDACs的作用。斑马鱼在视网膜损伤后每日腹腔注射溶剂对照二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或不同浓度的TSA(0.05、0.5和5 μmol/L)和VPA(2、20和200 μmol/L)，在4 dpi先腹腔注射BrdU标记MGPCs，3 h后收取眼球并进行冰冻切片。BrdU免疫荧光染色显示TSA和VPA处理剂量依赖的减少了4 dpi INL BrdU+细胞的数量(图2)，提示斑马鱼视网膜损伤后MGPCs的形成需要HDACs。

2.3 HDACs促进斑马鱼视网膜MG的增殖 MGPCs的形成主要包括MG去分化(0～2 dpi)、不对称分裂产生MGPC(2 dpi)和MGPC增殖(2～6 dpi)3个步骤[5,10]。为了解HDACs是否通过影响MG去分化和增殖调控MGPCs形成，本研究选用了转基因斑马鱼系TG(1016tuba1a:GFP)，该鱼系视网膜中去分化的MG会表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)[10]。转基因斑马鱼在视网膜损伤后接受溶剂对照或TSA处理，然后在2 dpi检测MG去分化和增殖情况。GFP/BrdU免疫荧光染色显示TSA处理对损伤区域GFP+MG的数量和形态无显著影响(图3A～B)，但导致INL GFP+/BrdU+细胞数量显著减少(图3A、C)，提示HDACs不是MG的去分化过程所必需，但会促进其不对称分裂产生MGPCs。

2.4 MGPCs的细胞周期进程需要HDACs为了解HDACs是否影响MGPCs的细胞周期进程，本研究进行了谱系追踪实验。在2 dpi腹腔注射BrdU标记增殖的MGPCs，然后在4 dpi通过冰冻切片进行PCNA免疫荧光染色(图4A)。在4 dpi视网膜内PCNA+BrdU+细胞数量/BrdU+细胞数量的比值可以反映BrdU标记的MGPCs后代在4 dpi时仍处于细胞周期中的比例。实验结果显示TSA处理显著降低了该比值(图4B～C)，提示MGPCs的细胞周期进程是需要HDACs的。进一步通过qPCR分析了TSA对视网膜内细胞周期相关基因表达的影响，qPCR结果显示TSA处理导致p21、p27和p57 3个周期素依赖激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的表达显著升高，而细胞周期素ccnd1的表达显著下调(图4D)，这与观察到的增殖抑制表型相一致。TSA处理也导致2 dpi细胞周期素ccna2和ccne1的表达升高(图4D)。这些结果显示TSA处理干扰了细胞周期相关基因的正常表达，提示HDACs可能通过影响细胞周期相关基因的表达调控MGPCs的细胞周期进程。

3 讨论

近年来，表观遗传学在神经系统再生中的作用越来越得到重视。HDACs是一类蛋白酶，与组蛋白乙酰转移酶一起在染色质的结构改变和基因表达调控中发挥调控作用。HDACs的作用是将组蛋白末端的赖氨酸脱乙酰化，导致染色质结构变得更加紧密从而抑制基因表达[15]。多项研究[16-17]报道在神经系统损伤后，HDACs在神经元轴突再生中起着重要作用。在视网膜再生中，通过在小鼠MG内表达重编程因子Ascl1以及同时使用HDACs抑制剂，可以使小鼠MG转分化为视网膜中间神经元[18]。本研究检测了斑马鱼视网膜损伤后多个hdac基因的表达，并通过抑制剂TSA和VPA研究了HDACs在视网膜再生中的作用。

QPCR结果显示在视网膜针刺损伤后12 h几乎所有的hdac均表现出不同程度的表达下调，推测在视网膜再生的早期阶段，即MG的重编程过程，可能需要短暂的泛HDACs下调以利于再生基因的表达。在损伤后1～2 d，hdac3、hdac4、hdac5和hdac7a的表达出现了显著的上调，这一时间段是MG完成去分化、开始不对称分裂产生MGPCs的阶段[10]，提示这4个HDACs可能在MG分裂和MGPCs增殖中发挥作用。一些HDACs在损伤早期下调而在后期上调，提示它们可能在视网膜再生中有双重作用。但更细致的作用机制还需要进一步表达和功能研究，如针对具体的HDACs进行原位杂交以确定其表达的位置和细胞类型，特异敲降不同的hdac基因以研究其功能等。

本研究发现HDACs主要参与调控MG和MGPCs的增殖。BrdU免疫荧光的结果显示HDACs对MG的不对称分裂有促进作用。进一步的谱系追踪显示缺失HDACs功能的MGPCs有更高的比例退出细胞周期，这提示HDACs是维持MGPCs细胞周期进程的重要分子。MG和MGPCs的充分增殖是视网膜再生能否成功的必要条件，也是斑马鱼能获得近乎完美的视网膜再生的关键因素之一[6]。现有的利用MG重编程转分化为视网膜神经元的技术，均存在产生的神经元数量有限，以及过多的转分化导致MG丢失进而可能影响视网膜正常生理功能等缺点[1,18]。因此，进一步研究HDACs促进MG和MGPCs增殖的机制，对于将来哺乳动物的视网膜再生可能有着重要的借鉴意义。HDACs有可能成为人类MG重编程和视网膜再生的治疗靶点，为治愈退行性视网膜疾病提供一种全新的思路。