LncRNA GAS5吸附miR-221-3p抑制肝细胞肝癌增殖及其启动子甲基化状态*

赵苏鸣 ，赵 辉，顾潍炜，杨晓虎，顾祝新，陈晓阳，李华镭，陶 霞

(南通大学附属医院1 肿瘤介入科，2 医学超声科，3 泌尿外科，4 药剂科，南通 226001)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌，是世界范围内的第六大常见癌症[1]，死亡率高[2]。中国每年HCC发病和死亡患者约占全球的一半[3]。传统手术治疗对部分HCC患者的病情改善虽有明显疗效，但相当数量的患者对治疗不耐受，易复发转移。目前对肝癌发生和进展的分子机制尚不完全清楚。因此，HCC相关调控机制成为目前研究的重点。

随着高分辨率芯片及高通量测序技术的发展，人们发现长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)不仅起转录干扰作用，而且是基因调控中不可或缺的部分。在HCC中，lncRNA的调控作用越发引起关注。LncRNA是一类长度＞200 nt的内源性RNA，在表观遗传水平、转录过程中发挥重要的调控作用。HCC相关的lncRNA以多种形式参与HCC进展调控[4-6]，但由于lncRNA高级结构和作用形式的复杂性和未知性，其在HCC中的调控作用尚需深入探讨。

最近研究[7]发现，lncRNA可作为内源竟争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)或称为microRNA海绵，竞争结合于miRNA反应元件(miRNA response elements,MREs)，抑制miRNAs的表达与功能，进而在转录后水平调节miRNAs靶基因——mRNAs的表达。生长抑制特异性基因5(growth arrest specific transcript 5,GAS5)位于1q25位点并含约630个核苷酸[8]，在多种常见的癌症类型中具有肿瘤抑制功能，包括乳腺癌[9]、肺癌[10]、肾癌[11]和结直肠癌[12]等。然而，GAS5的作用和甲基化状态及其在HCC发生中的作用尚未阐明。我们前期基于生物信息学的结果显示，GAS5转录本中存在hsa-miR-221-3p互补结合位点，而前期研究[13]中证实了AXIN2可作为miR-221-3p的靶基因，因此猜测GAS5-miR-221-3p-AXIN2三者可能存在调控关系。本研究主要通过在肝癌细胞中过表达GAS5探讨其对肝癌细胞增殖的影响，通过双荧光素酶验证其与miR-221-3p的结合情况，并从表观遗传角度初步了解其表达下降的机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源 肝癌及癌旁组织标本采集自南通大学附属医院。所有患者均签署书面知情同意，实验经南通大学附属医院伦理委员会批准。人肝癌细胞系(HCCLM3、HepG2和Huh7)和人正常肝细胞系LO2购自中科院细胞库。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-dC) 为Sigma产品；pcDNA3.1-GAS5质粒及对照，引物由南京金斯瑞生物公司合成；Lipofectamine2000和TRIzol试剂为Invitrogen品牌；DMEM培养基购自Gibco公司；荧光定量PCR试剂盒为赛默飞产品；CCK-8检测试剂盒购自碧云天公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 人肝癌及正常肝细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃5%CO2培养箱中培养。为检测GAS5过表达对肝癌细胞株的影响，分对照组和pcDNA3.1-GAS5过表达组(GAS5组)。转染步骤：细胞以1×106个/mL密度接种于6孔板，待细胞融合度约70%时进行转染。将1 μg DNA溶于50 μL Opti-MEM无血清培养基中，将2 μL Lipofectamine2000溶于50 μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀室温放置5 min。将两管混合，放置20 min。将上述复合物加入6孔板中，在基础培养基中培养6 h后，弃去并加入完全培养基继续培养。将培养细胞分成4组(5-Aza-dC浓度分别为0、1、2、3 μmol/L)，并于加药后48 h检测。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRTPCR)检测 根据操作说明书，用TRIzol试剂提取组织和细胞样品的总RNA。用第一链cDNA合成试剂盒合成反向转录cDNA。采用SYBR green法进行qRT-PCR检测。PCR反应条件：先94 ℃5 min，后94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s共35个循环。以GAPDH的表达水平为内参。结果采用定量PCR中的相对定量法，以2-△△Ct表示目的基因相对于对照组的变化倍数。引物序列如下：GAS5上游引物，5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′；下游引物，5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′。GAPDH上游引物，5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；下游引物，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 CCK-8细胞增殖检测 收集对数生长期细胞，调节细胞密度，96孔板每孔加入100 μL约3 000个细胞，分别在转染或刺激后24、48、72、96 h每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h后，用酶标仪以450 nm波长测量各孔的吸光度值，绘制细胞生长曲线。每组设定3个复孔，重复实验3次，取其均值。

1.2.4 克隆形成实验 取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，形成细胞悬液。接种细胞悬液作梯度倍数稀释，按每皿含50、100和200个细胞的梯度密度，分别接种于含10 mL预温37 ℃培养液的培养皿中，然后以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀；在37 ℃，5%CO2及饱和湿度的环境下，静止培养3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃培养液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定15 min。弃固定液，加适量姬姆萨应用液染色30 min，然后流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

1.2.5 划痕实验 先用记号笔在6孔板背后均匀划横线，约每隔1 cm一道，横穿过孔，每孔穿过5条线。接种细胞，待细胞铺满板底后用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37 ℃5%CO2培养箱中继续培养。本次实验按0 h和48 h取样，拍照。

1.2.6 细胞侵袭实验 实验前需先换无血清培养基培养细胞，清除血清的影响。将基质胶进行适当稀释，铺在上层Transwell小室中，置细胞培养箱中聚合过夜。下室培养基用含20% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培养基。胰酶消化细胞，制备细胞悬液，无血清培养基洗涤细胞并重悬。将上层小室放入下层小室，细胞计数后将细胞铺在上层小室中。细胞在培养箱中继续培养36 h。用棉签擦去上层小室里的细胞和基质胶，后用甲醇固定细胞5 min，姬姆萨染液染细胞后拍照。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测 在用萤火虫荧光素酶基因定量表达时，海肾荧光素酶报告基因作为对照。将构建的pmiR-RB-ReportTM-GAS5野生型和突变型质粒分别与miR-221-3p mimic和miR-con共转进HCCLM3细胞系中，检测荧光素酶基因表达，加入特定的荧光素酶底物，二者反应产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，结果以表示，两组间比较采用Student t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GAS5在肝癌细胞株和肝癌组织中表达显著下调 对GAS5在3种常见的肝癌细胞株中的相对表达量进行检测，结果发现，与人正常肝细胞LO2中的相对表达量相比，GAS5在肝癌细胞株中表达显著下调(P＜0.05，图1A)。同样的，GAS5在肝癌组织中表达明显较癌旁组低(P＜0.05，图1B)。

2.2 过表达GAS5明显抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及克隆形成 在GAS5过表达组，与对照组相比其相对表达量显著升高(P＜0.05，图2A)，说明转染成功。CCK-8结果显示，过表达GAS5后，HCCLM3细胞增殖明显受到抑制(P＜0.05，图2B)。划痕实验的结果表明，48 h后，GAS5组的划痕愈合百分比比对照组显著降低(P＜0.05，图2A～B)。Transwell结果发现，与对照组相比，GAS5组细胞数量显著下降(P＜0.05，图2C～D)。克隆形成实验结果表明，与对照组相比，GAS5组细胞克隆数显著减少(P＜0.05，图2E～F)。提示GAS5具有抑制肝癌细胞增殖的效应。

2.3 GAS5可与miR-221-3p互补结合 通过在线网站(http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php)预测，发现GAS5转录本中存在hsa-miR-221-3p互补结合位点(图3A)。本研究构建了pmiR-RB-ReportTMGAS5质粒，并将其与miR-221-3p mimic共转进HCCLM3细胞系中。双荧光素酶检测结果显示，在野生型中转染miR-221-3p mimic后相对荧光素酶活性显著降低，提示两者直接可互补结合(图3B)。

2.4 GAS5启动子CpG岛甲基化水平可能参与调控GAS5表达 通过在线网站(http://www.urogene.org/methprimer/)对GAS5启动子区域的CpG岛进行了预测，发现在该区域附近富集了多个CpG岛(图4A)。因此猜测，GAS5在肿瘤中低表达与GAS5启动子区域附近的CpG岛甲基化状态有关。通过肝癌细胞株中加入不同剂量的甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC进行了初步验证。结果表明，随着5-Aza-dC浓度逐渐变大，GAS5相对表达量呈现显著上调(图4B)，提示肿瘤中GAS5低表达与其启动子区域CpG岛甲基化水平有关。

3 讨论

HCC是人类最常见和最具侵袭性的恶性肿瘤之一[1]。尽管临床诊疗手段不断进步，但HCC的预后仍很差，特别是淋巴结转移或晚期患者。HCC诊断和治疗缺乏合适的分子标记是主要原因[14-15]。

LncRNA在HCC的发生、进展和转移中的重要作用越来越被重视。Lnc FTX在HCC组织中的表达与正常肝组织相比明显下调。高Lnc FTX表达的患者表现出较高的生存率，提示Lnc FTX是HCC患者的预后因素[16]。Lnc GAS5在多种癌症中表达下调，可调控细胞周期，影响细胞进程，通常发挥抑癌功能[9-12]。本研究发现，过表达GAS5抑制肝癌细胞的体外增殖，证实GAS5在HCC中也起着抑癌作用。

虽然GAS5已被证明是一种肿瘤抑制因子，但其潜在的分子机制尚不完全清楚。Lnc RNAs具有二级结构，促进它们与DNA和RNA的相互作用。因此，Lnc RNAs通常以序列特异性的方式通过与DNA或RNA结合来调节基因的表达[17-18]。Lnc RNAs通过与miRNAs的相互作用影响靶蛋白的表达。如Lnc MALAT1可作为HCC中miR-146-5p的分子海绵。过表达MALAT1与miR-146-5p结合，抑制miR-146-5p的表达，即miR-146-5p下游靶基因上调肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达，从而激活丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路促进HCC的进展[19]。在体外和体内，Lnc FTX可通过竞争性海绵吸附miR-374a抑制Wnt/β-catenin信号活性，抑制肝癌细胞上皮间充质的转化和侵袭[16]。Lnc HAGLROS在HCC组织中在HCC中高表达，通过miR-5095/ATG12轴和PI3K/AKT/mTOR信号通路参与细胞增殖、凋亡和自噬的过程[20]。本研究首先通过在线生物信息学预测了GAS5转录本中存在miR-221-3p互补结合位点，随后通过双荧光素酶实验验证了两者之间的相互结合，提示GAS5可作为分子海绵吸附miR-221-3p，进而影响下游靶基因的表达或相关肿瘤信号通路。

为从表观遗传角度解释GAS5在肿瘤中低表达，我们首先预测到GAS5启动子区附近存在多个甲基岛，进而通过在肝癌细胞系中加入不同剂量的甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC进行了初步验证。实验结果证实了GAS5低表达与其启动子区域CpG岛甲基化水平有关。由此初步明确了在肝癌细胞中由于GAS5启动子甲基化导致其表达量下调。通过5-Aza-dC的去甲基化处理，GAS5表达上调后作为分子海绵吸附miR-221-3p能力增强，进而抑制了肝癌细胞的增殖。

总之，本研究初步表明GAS5在肝癌组织和细胞系中的表达显著下调，与其CpG岛甲基化水平有关。GAS5可作为分子海绵吸附miR-221-3p抑制肝癌细胞增殖。