刺山柑果风湿止痛贴和温和灸对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织HSP70和PPARγ蛋白表达的影响

李 盼， 霍新慧， 毛丽旦·阿扎提， 昂沙尔·毕哈孜， 丁 霞

(新疆医科大学中医学院针灸基础教研室， 乌鲁木齐 830011)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以关节病变为主的自身免疫性疾病，由于患者会存在一定程度的关节功能障碍而严重影响人类健康和生活质量[1]。目前该病的病因和发病机制还未完全明确[2]，因此临床治疗仍然棘手，中医药在RA的治疗领域中因其症状改善明显而独具特色[3]。本课题组前期实验已证实，新疆刺山柑和祖国传统医学灸法对AA(adjuvant arthritis，佐剂性关节炎)模型大鼠有消炎止痛的作用[4]，本研究进一步从免疫调节角度，观察两种传统疗法对滑膜组织HSP70 (heatshockprotein70, 热休克蛋白70)和PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ，过氧化物酶体增殖剂激活受体γ)表达的影响，为其科学应用提供有力的支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级Wistar大鼠50只，雌雄各半，体质量约(180±20)g，由新疆医科大学动物中心提供，动物合格证号：SYXK(新)2016-0002，二级洁净动物房饲养，自由饮食和摄水。

1.1.2 药物与试剂完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)，特制香烟型纯艾条(南阳卧龙汉医艾绒厂，规格4 mm×120 mm)，悬灸支架(知福堂，蕲春上工记艾灸器具开发有限公司)，刺山柑果风湿止痛贴(批号20161022，由新疆医科大学中医学院中药资源教研室提供)，伤湿止痛膏(国药准字Z42020233，批号20130902，黄石市力康药业有限公司生产)。大鼠的ELISA检测试剂盒(均购自美国Bim公司)，HSP70抗体、PPARγ抗体和内参均购于英国ABCAM公司，批号分别是219228-27、GR3225403-5、GR3249122-1。

1.1.3 仪器与设备 多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；微型离心机：北京市六一仪器厂，型号WD-2105A；通用型电泳仪：美国BIO-RAD公司，型号Serial No.042BR11250；电泳槽：美国BIO-RAD公司，型号Mini PROTEAN Tetra Cell；超灵敏全自动成像分析系统：美国Proteinsimple公司，型号FluorChem E。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 随机(采用数字表法)选取10只大鼠作为正常组，进行AA大鼠造模(参照文献[5])：大鼠足跖皮内注射完全弗氏佐剂(0.1 mL/只)3 d后进行造模成功评定，依据AI(arthritis index，关节炎指数)评分[6]评定：无关节红肿计0分；足趾关节红肿计1分；趾关节和足趾肿胀计2分；踝关节以下红肿计3分；全部足爪(包括踝关节在内)肿胀计4分。AI值即每只大鼠四肢评分分数之和。评分达到6分以上即为造模成功。

1.2.2 分组与干预 将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药组、刺山柑组、艾灸组，每组10只。阳性药组和刺山柑组参照文献[7]分别予以伤湿止痛膏组(15 cm2/kg·d)和刺山柑果风湿止痛贴(30 cm2/kg·d)左后足跖经皮给药，模型组以同样方式予以空白凝胶膏剂。艾灸组选取肾俞、后三里穴(左右侧腧穴交替进行)，肾俞位于第2腰椎棘突下，左右侧旁开约7 mm处；后三里是膝关节后外侧，腓骨小头下5 mm。采用改良的温和悬灸方法[8]：用悬灸支架固定特制艾条，艾条点燃部位距穴区2 cm处施灸，每穴20 min，2个腧穴同时进行灸治，每日1次(上午9:00开始)。以上治疗均连续治疗6 d为1疗程，共治疗3个疗程，疗程间休1天。

1.2.3 AI指数、足爪容积测定 AI指数评分方法同前。采用之前方法[4]进行的足爪容积测定，即尽量将大鼠足跖垂直放入水中至标记线后取出，再用5ml注射器加水至原有水面高度，记录注射器的剩余水量，其差值即为大鼠的足爪容积。

1.2.4 血清 TNF-α、IL-1β水平的检测 采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清 TNF-α、IL-1β水平。具体步骤依照试剂盒操作。

1.2.5 滑膜组织HSP70、PPARγ蛋白表达测定 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL/100 g)后，完整剥离髌骨下滑膜组织，立即放置液氮中冷冻，并转移至-80℃超低温冰箱保存备用。0.1 g大鼠滑膜组织充分研磨(加入钢珠)后1 mL RIPA裂解液匀浆，17 000 rpm，4℃，10 min 取上清液按照BCA法测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，大鼠一抗HSP70、PPARγ(均为1∶1 000)4℃孵育过夜，经过PBS洗膜15 min 3次后，加入显色剂显色，曝光，冲洗，采用Gel Doc XR软件，计算目的蛋白与阶Actin吸光度值的比值。

2 结果

2.1 对AA大鼠AI指数和足爪容积的影响与正常组比较，大鼠在造模后的AI指数和足爪容积明显升高(P<0.01)；与模型组比较，治疗后各组AI指数和足爪容积明显降低(P<0.05或0.01)。结果见表1。

表1 各组大鼠AI指数和足爪容积比较

2.2 对AA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响与正常组比较，模型组AA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组TNF-α水平明显降低(P<0.05)，刺山柑组和艾灸组IL-1β水平也明显降低(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组血清TNF-α、IL-1β的比较(pg/mL， ±s)

2.3 对AA大鼠滑膜组织HSP70、PPARγ蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织HSP70、PPARγ蛋白表达明显升高(P<0.05、0.01)，刺山柑组和艾灸组HSP70蛋白表达明显升高(P<0.05、0.01)，各组的PPARγ蛋白表达均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组HSP70蛋白表达明显降低(P<0.05)，艾灸组HSP70蛋白表达明显升高(P<0.05)，刺山柑组PPARγ蛋白表达明显升高(P<0.01)；与刺山柑组比较，艾灸组的HSP70蛋白表达明显升高(P<0.01)，PPARγ蛋白表达明显降低(P<0.05)。结果见表3、图1。

表3 各组大鼠滑膜组织HSP70、PPARγ蛋白表达的比较(GAPDH， ±s)

a: HSP70电泳条带b: PPARγ电泳条带

c: HSP70蛋白表达

d: PPARγ蛋白表达

3 讨论

目前临床对RA的治疗有多种药物和手段，西医以药物治疗为主，但因药物的耐受性和伴随副作用而不够理想，中药具有疗效肯定，毒副作用少等优点[3]而成为研究热点。刺山柑(又名野西瓜、槌果藤等)，在我国主要分布在西部的新疆等地，具有祛风、散寒、除湿等作用[9]，在治疗RA方面疗效肯定且起效迅速[10]，可能的作用机制是镇痛、抗炎、免疫抑制 、抑制软骨和骨破坏等作用[11]。

RA属中医学“痹证”，病机是本虚标实，本虚是指肝肾亏虚，气血不足，标实即风、寒、湿、热邪痹阻经脉。作为中医学传统外治疗法，艾灸以“温热刺激”为主要作用形式，在治疗RA方面取得了显著的临床效果，有良好的抗炎、消肿、镇痛作用[12]，能够增强和改善机体的免疫功能，促进炎症损伤的修复[13]和内环境的稳态。

肾俞是人体“先天之本”肾气输注于背腰部的腧穴，具有补肾培本、补益先天的功效。足三里属于局部取穴，可起到通络止痛的近治作用，又因是人体“先天之本”胃的合穴、胃下合穴，也具有扶助正气、补益气血的全身作用。温和灸二穴，远近同治、标本兼顾，共奏扶阳补益之效。

TNF-α和IL-1β都是典型的炎性细胞因子，在RA的发病中起着“中心罪犯”作用[14]。热休克蛋白是RA在关节的炎症病变中，释放出促关节破坏及病理进程的内源性生物因子之一，是机体细胞在热休克或如病毒、缺氧等其他外来刺激情况下诱导产生的[15]，HSP70被认为是最保守、最主要的一组HSPs,也是与炎症作用相关的重要细胞内蛋白[16]，在RA发生、发展中既可以启动免疫调节通道以抑制免疫反应[17]，又可以通过抑制TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达从而发挥抗炎作用[19]。PPAR是一类由配体激动的核转录因子[18]，PPARγ是PPARs重要的亚型之一，研究显示，PPARγ是反映RA疾病活动度的一个有效指标[19]，在RA的发生及发展中，可产生多种生物学效应，具有较强的抗炎作用[20]。

本研究表明同样是传统医学的外治方法，刺山柑和艾灸疗法都能有效的缓解佐剂性关节炎大鼠足部炎症和肿胀度，下调抗炎因子TNF-α、IL-1β水平。刺山柑可能的作用机制是上调抗炎蛋白PPARγ的表达，而艾灸是激活胞内源性保护蛋白HSP70的表达，从而最终都达到调节免疫功能而发挥抗炎的效应。