PI3K/AKT信号通路对糖尿病大鼠血糖及骨骼肌GSK-3β表达水平的影响

史浩楠， 王婷婷， 董惠娟， 张羽珊， 姚 健， 张鹏程

(1新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐 830011； 2上海健康医学院护理与健康管理学院健康服务与健康管理教研室， 上海 201318)

2型糖尿病在全世界的发病率，正呈逐年上升趋势。在我国，于1979 年、1994 年、2007年以及2010 年分别进行了 4 次大规模的糖尿病流行病学调查，于2010年的调查结果可知，我国约有近1.139亿人患糖尿病[1]。2型糖尿病的发病与胰岛β细胞受损具有密切关系[2]，其在环境以及遗传等诸多因素的影响下，常表现为胰岛素抵抗。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路是细胞内的重要信号传导通路，其主要作用为促进细胞的生长、增殖，抑制细胞的生长阻滞与凋亡[3]。近年来，PI3K/AKT通路在肝纤维化、糖尿病与阿尔茨海默病等领域备受国内外学者的关注[4-5]。

糖原合成激酶(GSK-3β)是AKT的重要底物，其对胰岛素信号通路具有负反馈调节作用，并在血糖稳态调控中起到重要的作用[6-7]。本次实验在建立2型糖尿病大鼠模型时，同步使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002，观察血糖与骨骼肌组织中GSK-3β蛋白表达的变化，研究PI3K/AKT信号通路对血糖与GSK-3β的调节作用，探讨该通路对2型糖尿病发病的影响，为2型糖尿病的预防与治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠40只，雄性，体质量250～280 g，购买自新疆医科大学动物实验中心，饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级实验环境[SCXK(新)2016-0003；使用许可：SYXK(新)2016-0002]。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸、柠檬酸钠、胆固醇、果糖、蔗糖、甲基硫脲嘧啶、丙二醇、吐温80、谷氨酸钠、戊巴比妥钠、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(以上均购买自北京索莱宝科技有限公司)，LY294002(美国MCE公司)，兔抗PI3K一抗(武汉华美生物工程有限公司)，兔抗AKT1/2/3一抗(武汉博士德生物科技有限公司)，兔抗GSK-3β一抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)、山羊抗兔HRP标记二抗(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)、GAPDH内参蛋白(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)、辣根过氧化酶化学发光显色剂、EDTA蛋白酶抑制剂、考马斯蓝蛋白定量试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、普通大鼠饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司)。

1.2.2 主要仪器 酶标仪(Varioskan Flash)、高速冷冻离心机 (HC-3018R)、低速冷冻离心机(KDC-2046)、血糖仪及配套试纸(拜安捷2)。

1.2.3 主要溶液的配制

1.2.3.1 脂肪乳的配置 胆固醇6 g，果糖5 g，蔗糖5 g，吐温-80 6 mL，丙二醇20 mL，谷氨酸钠1 g，甲基硫脲嘧啶0.5 g，猪油20 g。将新鲜猪板油置于铁锅中加热，直至油渣呈金黄色后，将油渣捞出，待猪油冷却后，经六层纱布过滤，盛放于烧杯中待用。A液：将6 g胆固醇加入20 g猪油中，置于电热炉上加热至完全溶解后，向其中加入聚山梨酯-80 20 mL备用；B液：将果糖5 g、蔗糖5 g、甲基硫脲嘧啶0.5 g，谷氨酸钠1 g加入烧杯，并在烧杯中加入少量蒸馏水，置于电热炉上加热至完全溶解后，再向其中加入丙二醇20 mL。将B液倒入A液中，用玻璃棒快速搅拌，与此同时，向溶液中加入蒸馏水定容至100 mL，待溶液完全冷却后停止搅拌，制成脂肪乳。

1.2.3.2 STZ的配置 A液：将柠檬酸2.1 g加入双蒸水100 mL中 ；B液：柠檬酸钠2.94 g加入双蒸水100 mL。将A、B 液按1∶1比例混合，将pH调至4.2～4.5，经灭菌后置于4℃冰箱保存备用。将链脲佐菌素按照1%浓度溶解在缓冲液中，避光保存，现配现用。

1.2.3.3 LY294002溶液的配制 将二甲基亚砜按照2‰浓度溶解在生理盐水中，配置成2‰DMSO溶液，将LY294002溶解在配置好的DMSO溶液中，浓度为0.05 mg/mL。

1.3 实验方法将40只SD大鼠随机分为4组，即正常对照组(N组)、糖尿病组(G组)、DMSO组(D组)、抑制组(L组)，每组10只。适应性喂养1周后，检测各组大鼠血糖(GLU)。G、D、L组每日灌胃脂肪乳剂，N组灌胃同等剂量的纯净水，剂量为10 mL/kg。同时N、G组每日腹腔注射生理盐水，D组每日腹腔注射DMSO溶液，L组每日腹腔注射LY294002溶液，剂量均为6 mL/kg。至实验第10日，禁食12 h，同时给G、D、L组腹腔注射STZ溶液，剂量为40 mg/kg，建立糖尿病模型。继续干预至第15日，禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉受试动物，使用组织剪剪开腹腔，腹主动脉取血检测GLU，处死受试动物，取下右侧股四头肌，使用锡箔纸包裹置于液氮中速冻，1 h后转移至-80℃冰箱保存待检。以1999年WHO推荐的随机血浆葡萄糖浓度≥11.1 mmol/L作为糖尿病的成模标准，若未达标则予以剔除。

1.4 检测指标

1.4.1 体质量 于实验前测量大鼠体质量一次，之后，每2日称重一次，直至实验结束。

1.4.2 血糖(GLU) 于实验前禁食12 h后剪尾法收集血液，使用干化学法检测血糖，实验第15日禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血检测GLU。

1.4.3 Western-blot法检测骨骼肌中PI3K/AKT/GSK-3β表达水平 (1)取约1 g骨骼肌于锡箔纸包裹的干净研钵中，完全研磨后放入1.5 mLEP管中，加入1 mL蛋白抽提液(按蛋白酶抑制剂与强RIPA裂解液1∶100比例配置)，涡旋机混匀，超声仪破细胞，14 000 r，4℃，15 min离心，取上清分装于小EP管中。(2)取5 μL蛋白上清液,用1×PBS稀释成100 μL，加入1 mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置10 min，取200 μL于酶标板，在波长595 nm处检测OD值，根据标准曲线计算蛋白上清中总蛋白含量。加入1×PBS和4×Loading Buffer，将各组蛋白统一稀释成2 μg/μL，100℃水浴20 min，流水冲洗15 min降温,保存于-80低温冰箱。(3)选用10%的分离胶与5%的浓缩胶，蛋白Marker加样5 μL，煮好的蛋白样品加样20 μL，在80 V电压下跑胶30 min，100 V电压跑胶60 min，120 V电转2 h。取出PVDF膜，按照蛋白Marker切割目的蛋白条带。5%的脱脂奶粉封闭液(1×TBST配制)封闭1 h，加入兔抗鼠一抗(PI3K、AKT、GSK-3β、内参GAPDH稀释比例分别是1∶3 000、1∶200、1∶1 000、1∶3 000)，4℃摇床孵育，次日回收一抗，TBST洗脱三次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗(稀释比例为1∶3 000)进行孵育2 h。(4)回收二抗，TBST洗3次，每次10 min，ECL(A、B、C组分别按1 000∶1 000∶1配制)显色，Image Lab曝光条带。

使用Image J软件分析目标条带的光密度值，采用GAPDH作为内参，使用Image Tool软件进行定量分析。

2 结果

2.1 各组体质量水平比较各组体质量实验前至实验第10天的比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，实验第12天至第14天实验结束，各组体质量的比较差异有统计学意义(P<0.05)，经两两对比，L组的体质量显著低于其余3组，其余3组间无差异，见表1。

表1 各组实验前后体质量的比较

2.2 各组GLU水平比较实验后，除L组死亡1只动物外，G、D、L组动物糖尿病均已成模。各组大鼠实验前GLU的比较差异无统计学意义(F=1.57,P>0.05)，实验后各组GLU水平差异有统计学意义(F=58.96,P<0.05),经两两对比G、D、L组GLU均高于N组，G、D组GLU水平差异无统计学意义，实验后L组GLU水平高于其余3组，见表2。

2.3 各组骨骼肌PI3K/AKT/GSK-3β Western-blot法检测结果各组PI3K/AKT/GSK-3β表达差异均有统计学意义(P均<0.01)。PI3K表达水平G、D、L组均低于N组，G组与D组间差异无统计学意义，L组低于G、D组；AKT表达G、D、L组均低于N组，G组与D组间差异无统计学意义，L组低于D、G组；GSK-3β表达G、D、L组高于N组，G组与D组间差异无统计学意义，L组高于D组，见图1、表3。

表2 各组实验前后GLU水平比较

图1 各组骨骼肌PI3K/AKT/GSK-3β

3 讨论

糖尿病是一种受环境因素以及遗传因素共同影响的疾病，其主要病因是胰岛素抵抗[8]。骨骼肌是胰岛素抵抗发生的重要场所，因此本实验使用骨骼肌作为大鼠组织的研究对象。PI3K/AKT信号通路与细胞增殖及凋亡等行为密切相关，其中PI3K是一类胞内磷脂酰肌醇激酶，能够激活蛋白激酶B，抑制下游糖原合成酶的活性，促进糖原合成以及葡萄糖的转运，从而降低血糖水平[9]。AKT是PI3K的下游效应分子，有AKT1、AKT2、AKT3 3个亚型。有研究表明[10],AKT的3个亚型基因剔除的小鼠均会表现出不同程度的血糖异常,说明AKT在调节血糖方面有着重要的作用。根据本次实验结果可见，G组PI3K/AKT的表达均明显低于N组，该结果与师林等[11]和钟文等[12]研究糖尿病大鼠PI3K/AKT的表达结果是一致的。PI3K/AKT信号通路能够通过磷酸化多种底物，促进胰岛β细胞的生长、增殖并抑制胰岛β细胞凋亡[13],而患糖尿病的大鼠PI3K/AKT表达水平下降，可能是由于大鼠患糖尿病后，因胰岛素抵抗，导致胰岛素不能与胰岛素受体正常结合，胰岛素受体底物不能被正常激活，从而使其下游信号分子的级联反应受到了抑制，而PI3K/AKT正是重要的胰岛素受体底物，因此其表达受到了抑制。

GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有研究证实GSK-3β活性增强可致糖尿病动物产生不利后果[14]。本次实验中，G组GSK-3β表达水平显著高于N组，该结果与刘冬恋等[15]研究2型糖尿病大鼠骨骼肌GSK-3β表达的结果是一致的。胰岛素分泌不足是2型糖尿病的典型症状，在正常情况下，胰岛素可以通过磷酸化GSK-3β使其失活，过度表达的GSK-3β则可以通过抑制葡萄糖的生物活性，从而降低肌糖原的合成，导致GLU水平升高。通过观察L组GLU及GSK-3β表达水平进一步证实了，GLU水平可能受到GSK-3β的调节，这一结果与唐皓月等[16]通过对糖尿病的动物使用GSK-3β抑制剂，使得GLU水平降低相符合，提示GSK-3β表达水平与GLU水平呈正相关趋势。L组通过使用PI3K/AKT信号通路抑制剂使GKS-3β表达水平上升提示，PI3K/AKT信号通路对GLU水平的影响很可能与GSK-3β有关，并且二者呈负相关趋势。

综上所述，糖尿病的发生与PI3K/AKT通路受损具有密切的关系，其机制很有可能与GSK-3β有关。因此，进一步研究PI3K/AKT信号通路在糖尿病发病中的作用及机制，能够为糖尿病的治疗提供更多有价值的依据。