慢性乙型肝炎患者外周血调节性T细胞、Th17细胞的水平及与乙肝表面抗原滴度的相关性

朱义玲， 甘建和， 赵卫峰， 孙 蔚， 陈 丽

我国是慢性乙型肝炎（CHB）的高发区，相关调查显示，目前我国乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）携带率为7.18%，乙肝病毒（HBV）感染者高达9 300万，其中CHB患者约2 000万，占全世界的三分之一[1-2]。CHB的发生发展及转归与机体的细胞免疫功能密切相关，尤其以效应CD4+T淋巴细胞发挥的作用最为关键，其中调节性T细胞（Treg细胞）和Th17细胞在CHB中抗炎和促炎的作用已得到证实，且Treg/Th17比值的大小亦成为评估疾病严重程度的免疫指标[3]，而HBsAg滴度水平是CHB患者能否成功治愈的关键，也是对HBV免疫控制比较直观的指标，因此本研究选择相关病例进行Th17和Treg细胞的检测，评估其与HBsAg的相关性及其在CHB发展过程中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性研究2018年1－12月在苏州大学附属第一医院感染病科住院治疗的CHB患者38例（乙肝组），男 29例，女9例，平均年龄（51.9±15.5）岁；乙肝肝硬化（LC）患者30例（肝硬化组），男25例，女5例，平均年龄（54.1±13.2）岁；选择20名健康体检者作为正常对照组，男15例，女5例，平均年龄（48.4±8.4）岁。患者纳入标准：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2017年版）》。排除其他嗜肝病毒（甲、丙、丁、戊）感染；排除酒精性肝病及自身免疫性肝病；排除合并其他重大疾病。所有研究对象均知情同意，研究方案取得医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂、仪器及检测方法

1.2.1 流式细胞检测 所用仪器为Beckman Coulter公司Epics XL4C。所用主要试剂分别为：BD公司的IL-17A-PE，Beckman Coulter公司的CD4-FITC、CD127-PE、CD3-ECD、CD25-PC5和C8-PC5。采集2 mL静脉血于肝素抗凝管中，上下颠倒混匀 5 次，2 h内送检。

Th17细胞检测步骤：因淋巴细胞刺激剂中的离子霉素和佛波酯会使淋巴细胞表面CD4分子表达明显下降，有研究表明CD3+CD8-细胞可反映CD4+T细胞的数量[4]，故本实验以CD3和CD8抗体作标记，具体步骤如下，取 30 μL刺激剂（BD白细胞刺激剂：1640培养液=1∶50）加入 50 μL全血中，震荡混匀于 37℃ 5% CO2培养箱中孵育5 h，加入CD3-ECD 和 CD8-PC5各5 μL，震荡混匀避光标记15 min，加入100 μL固定剂震荡混匀避光10 min，加入 1 mL PBS 震荡混匀后1 500 r/min离心5 min 弃上清液，加入100 μL破膜剂震荡混匀，37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育10 min后1 500 r/min 离心5 min 弃上清液，加入IL-17A- PE 5 μL震荡混匀避光标记15 min，用500 μL PBS 重悬混匀后上机，计数3 000～5 000 个细胞。

Treg细胞检测步骤：CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 单抗各5 μL加入50 μL 全血中，震荡混匀避光标记15 min，加入自制的红细胞裂解液 A 液600 μL，震荡混匀至澄清约8 s加入B液265 μL，震荡混匀后1 500 r/min离心5 min弃上清液，用 500 μL PBS重悬混匀后上机，计数3 000～5 000 个细胞。

以上经上机采集的数据经CXP软件分析，获得最终结果。

1.2.2 乙肝两对半定量数据 采集静脉血分离血清标本，经本科实验室罗氏cobas e 411仪器检测，获得HBsAg定量的结果。相关生化数据均由本院临床检测中心完成。

1.3 统计学分析

应用 SPSS 22.0软件包进行统计学处理 ，计量资料符合正态性分布以x±s表示 ，非正态分布计量资料以中位数（四分位数）表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，相关分析采用Spearson法。P＜0.05 为差异有统计学意 义。

2 结果

2.1 一般资料比较

CHB组、LC组和健康对照组临床资料见表1。三组研究对象性别、年龄差异无统计学意义。CHB组和LC组的HBV-DNA及丙氨酸转氨酶（ALT）指标均高于健康对照组，差异存在统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Th17、Treg百分率及Treg/Th17比值比较

CHB组、LC组和健康对照组外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值见图1和表2。与健康对照组比较，CHB组Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值均明显升高，且组间差异有统计学意义（P＜0.01）。CHB组与LC组比较，Treg、Th17百分率差异存在统计学意义（P＜0.05），而Treg/Th17比值差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 CHB组Th17、Treg百分率及Treg/ Th17比值与HBsAg滴度的相关性分析

C H B组H B s A g滴 度 为6 4 7.8 8（1 8 5.8 1，1 009.85）IU/mL，HBsAg与Treg百分率具有统计学意义的正相关性（r=0.73，P＜0.05），而与Th17百分率（r=-0.16，P=0.35）及Treg/Th17比值（r=-0.05，P=0.77）无明显相关性。见图2。

表1 CHB组、LC组与健康对照组临床资料比较Table1 Clinical data of chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis compared with healthy subjects

图1 健康对照组、 CHB 组和LC组Th17（CD3+CD8-IL-17+） 、Treg（CD4+CD25+CD127low）细胞流式图Figure 1 Flow cytometry diagrams for Th17 cells （CD3+CD8-IL-17+） and Treg cells （CD4+CD25+CD127low） in healthy subjects，chronic hepatitis B， and hepatitis B cirrhosis.

表2 CHB组、LC组与健康对照组外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值比较Table 2 Th17， Treg cell percentage and Treg/Th17 ratio in peripheral blood compared between chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis and healthy subjects

图2 CHB组Treg与HBsAg的相关性分析Figure 2 Correlation between Treg and HBsAg in chronic hepatitis B patients

3 讨论

我国是CHB高发国，每年因乙肝带来的各种并发症如肝硬化、肝癌、肝衰竭给社会和家庭带来沉重的负担，因此降低这些肝病的发生率，控制乃至完全治愈CHB是关键，但是在临床治愈方面仍存在很多疑点和难点，可以肯定的是机体免疫功能与CHB各种临床预后有着密切的相关性。

Treg细胞是T淋巴细胞亚群，在HBV 感染中高表达的 Treg细胞和树突状细胞数量减少及功能受损引起特异性CD8+T细胞数量减少及功能损伤，从而不能有效刺激机体产生特异性抗病毒免疫应答[5-6]。另外，Treg细胞还可通过抑制固有免疫和适应性免疫淋巴细胞的增殖及相关细胞因子的分泌，或通过细胞与细胞的直接接触来持久性地抑制 CD8+T 细胞和 NK 细胞的细胞毒作用，减少免疫性肝损伤，而导致HBV 持续感染及原发性肝癌进展[7]。研究发现，CHB患者外周血中 Treg细胞数量明显高于 HBV 携带者、恢复期和健康者，且与HBV e抗原（HBeAg）滴度和血清 HBV-DNA 水平呈正相关[8]。

近年来，Th17细胞在CHB致病过程中的作用已得到证明，但目前的研究对于 Th17 细胞在CHB中的变化趋势存在一定的争论。Feng等[9]研究发现CHB患者外周血 Th17 细胞数量表达显著上调，并与肝组织炎性活动程度呈正相关，Th17细胞诱导炎症的发生，Treg细胞则抑制已经发生的免疫炎性反应，两者相互作用使机体处于复杂而精细的 Treg/Th17 平衡状态，维持机体免疫状态的相对稳 定。

为了进一步研究CHB患者的免疫状态，本研究中检测了38例CHB患者外周血的Treg、Th17百分率以及Treg/Th17比值，结果表明CHB患者这三者水平均较健康人明显升高，差异有统计学意义；并对比了30例LC患者外周血的Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值，前两项数据差异存在统计学意义。在CHB患者中， Th17细胞的增殖并释放细胞因子如IL-17等引起免疫损伤，造成肝组织炎症加剧，而Treg细胞亦相应增加来抑制炎性活动从而缓和Th17细胞及其他免疫细胞带来的免疫损伤[10]，提示CHB患者可能处于一种Th17细胞增多并趋于优势地位的Treg /Th17免疫失衡状态，这可能是导致肝脏炎性反应的重要因素。有研究显示 HBV 携带者、CHB、静止期肝硬化、活动期肝硬化患者 IL-17 的表达依次升高，提示 Th17 细胞及 IL-17 介导的免疫反应与 HBV 感染的严重程度及肝细胞损伤机制有关，这与本研究结果相符。因此，在CHB的发展与转归过程中，检测Th17和Treg细胞对预后评估有积极的作用。

HBsAg是HBV感染肝细胞后产生的重要抗原，HBsAg诱发的细胞免疫、体液免疫反应对抑制HBV复制及杀灭病毒至关重要，且与HBV感染的进程及预后密切相关，在 CHB 病情发展的不同阶段，血清 HBsAg 滴度呈现不同[11]。尹艳霞等[12]研究显示HBeAg 阳性的 CHB患者，当处于免疫耐受期时 HBsAg 定量最高，在HBeAg 阴性的低复制期患者中最低。因此，可以认为HBsAg与患者免疫功能水平密切相关，但关于这方面的研究鲜有报道，本研究检测了CHB患者的HBsAg滴度，并将其与患者的外周血Treg、Th17百分率及其比值进行了相关性分析，结果发现CHB患者HBsAg与Treg百分率具有明显的正相关性，而与Th17百分率以及Treg/Th17比值无明显的相关性，考虑可能是因为CHB时，机体针对HBV的特异性免疫被激活，升高的HBsAg能够刺激特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）[13]，而Treg细胞则可以抑制过强的免疫应答以免造成严重的免疫损伤如肝衰竭等，从而维持免疫稳态， 但CHB患者大多数接受了抗病毒治疗，HBV-DNA大部分均为阴性，而这可能干扰了Th17细胞水平的变化，进而影响HBsAg的清除。虽然这只是猜测之一，还需要更多的研究支持，但对免疫机制复杂的CHB，仍需更多的研究和探讨。