艰难梭菌芽孢形成与萌发的研究进展

赵宝鑫， 强翠欣， 赵建宏

艰难梭菌是一种可形成芽孢、产生毒素的革兰阳性杆菌，是引起医院感染的重要致病菌之一[1]。艰难梭菌生长繁殖需要严格的厌氧环境，芽孢是感染和传播的重要形式。在艰难梭菌感染患者的肠道内，芽孢萌发成为繁殖体，后者产生毒素，引起腹泻或伪膜性肠炎等疾病。同时，繁殖体形成难被清除的芽孢，导致感染复发，芽孢也可能播散到环境中[2]。艰难梭菌的芽孢形成、萌发过程和芽孢结构等的研究进展缓慢，其过程与芽孢杆菌属和梭菌属细菌差异显著，本文就艰难梭菌芽孢研究成果作一综述。

1 艰难梭菌芽孢形成

艰难梭菌芽孢由内膜、芽孢壁、皮质、外膜等多层结构包被，且细胞质高度脱水浓缩，对各种不利条件的抵抗能力增强，利于其在体内外环境中传播。艰难梭菌芽孢形成过程包括4个阶段：①不对称分裂，形成前芽孢和母细胞；②母细胞裹吞前芽孢；③芽孢皮质、芽孢壳及芽孢外衣包绕前芽孢；④母细胞裂解，释放成熟芽孢[3]。

1.1 艰难梭菌芽孢形成的起始信号转导

艰难梭菌芽孢形成的引发信号及分子机制尚未完全阐明。基于Higgins等[4]对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的研究推断，艰难梭菌芽孢形成与营养不足或群体感应等环境压力密切相关。Spo0A蛋白是芽孢形成信号向下游传递的关键分子，Spo0A被磷酸化激活后才可发挥其功能[5]，见图1。Narula等[6]发现，芽孢杆菌细胞膜上的组氨酸激酶通过Spo0F/Spo0B磷酸基转移系统激活Spo0A。然而尚未在艰难梭菌中发现组氨酸激酶或磷酸基转移系统的同源基因。Underwood等[7]在艰难梭菌630菌株基因组上鉴定了5个基因（CD1352、CD1492、CD1579、CD1949和CD2492）可编码孤儿组氨酸激酶，并发现通过ClosTron敲除CD2492基因的艰难梭菌突变株产芽孢能力明显降低，推测其可能参与Spo0A激活。研究还发现CD1579可自磷酸化，并将磷酸基直接转移到Spo0A。Childress等[8]指出，CD1492是艰难梭菌芽孢形成的负调节子。研究发现codY和sinR基因缺失可抑制芽孢形成，并推测Spo0A激活过程受到抑制[9-10]。这些研究结果提示，艰难梭菌存在不同于其他细菌的Spo0A激活系统。不同研究发现亮氨酸反应调节蛋白和RstA蛋白可分别抑制或促进芽孢形成[11-12]，但具体机制是否涉及Spo0A的激活过程还有待研究。

图1 艰难梭菌芽孢形成过程中的信号通路

1.2 RNA聚合酶σ因子的区域性激活

激活的Spo0A-P可促进RNA聚合酶σ因子（σE、σF、σG及σK）的表达，各σ因子进而识别特定的启动子，调节相应基因表达，其中σE和σK在母细胞中发挥作用，σF和σG在前芽孢中行使功能[13-14]，见图1。各σ因子的级联激活过程如下：①芽孢形成开始后，前芽孢中SigH和Spo0A-P与spoⅡAA–spoⅡAB–sigF操纵子上游的启动子结合启动转录[15]。Campbell等[16]发现枯草芽孢杆菌中，σF与抑制因子SpoⅡAB分离才能在早期的前芽孢中发挥作用。艰难梭菌中σF的活性如何调控，尚需实验证明。②不对称分裂完成后，SigA和Spo0A-P启动spoⅡGA–sigE–sigG操纵子转录，后期SigF和SigG先后与sigG基因上游的启动子结合，启动sigG转录，裹吞完成后SigG活性的调节需SigE及母细胞与前芽孢之间的SpoⅢAH-SpoⅡQ通道参与[17-18]。sigG基因转录是如何被精细调节及其活性在不同阶段受何种因素的影响，还有待深入研究。③母细胞中，SigA和Spo0A-P共同启动spoⅡGA–sigE–sigG操纵子转录[19]。枯草芽孢杆菌中，pro-σE末端的肽段需要被SpoⅡGA蛋白酶切除才能激活。研究表明，艰难梭菌pro-SigE的激活并不需要SpoⅡGA参与，可能存在其他激活机制[20]。④sigK基因的转录前期由SigE启动，后期依靠SigK的正反馈调节，并受到SpoⅢD的正向调控[21]。与枯草芽孢杆菌不同，艰难梭菌中SigK的表达与SigG无关，但可能受到SigF的影响[22]。综上，艰难梭菌芽孢形成过程中，前芽孢与母细胞中σ因子的激活过程基本相互独立，并不像枯草芽孢杆菌复杂。艰难梭菌各σ因子的级联激活与不对称分裂和裹吞等时间节点也无直接关联[23]。

1.3 RNA聚合酶σ因子的功能

RNA测序和微阵列分析显示[20，24-25]，芽孢形成过程中200多种基因受到4种σ因子的调节：σF调控母细胞-前芽孢信息交流的spoⅡR、spoⅡQ及spoⅣB的转录，芽孢抵抗性相关蛋白主要依赖σG特异性调节，σE在前芽孢的裹吞、皮质及芽孢壳蛋白质的合成及芽孢成熟时所需的能量代谢方面发挥关键作用，σK影响芽孢壳及芽孢外衣的合成及组装和成熟芽孢的释放过程。综合这些研究结果不难发现，与芽孢杆菌属及梭菌属细菌相比，艰难梭菌中的4种σ因子的功能和芽孢形成调控网络独树一帜，反映了其作为一种肠道定植细菌为适应生存环境而进化出的特征。

2 艰难梭菌芽孢结构

2.1 艰难梭菌芽孢的基本结构与其抵抗性

艰难梭菌芽孢最内层是芽胞核心，包含基因组DNA、各种RNA、蛋白质和核糖体[26]。Redondo-Solano等[27]发现，核心含有大量的吡啶二羧酸钙（CaDPA）和α/β型小酸溶性蛋白质（SASP），含水量较低。这些特点使芽孢对各种刺激，如基因毒性药物、干燥剂、干热及湿热、紫外线及γ射线等，具有较强的抵抗性。核心外层是与繁殖体细胞膜具有相似磷脂组成的内膜，内膜对小分子物质的通透性较低，内膜外层是含肽聚糖的芽胞壁、由特殊的肽聚糖组成的较厚的皮质层以及来源于母细胞的外膜[28]。最外层为芽孢壳及芽孢外衣，是艰难梭菌芽孢研究热点。

研究发现，尽管艰难梭菌和枯草芽孢杆菌芽孢壳结构相似，均为层状结构的蛋白质[29]，但后者编码芽孢壳蛋白的基因仅有25%与艰难梭菌同源[30]。艰难梭菌芽孢最外层呈毛发样突起，蛋白质组成的芽孢外衣[31]。透射电镜研究发现，艰难梭菌芽孢外衣与芽孢壳层紧密连接，但艰难梭菌630菌株芽孢外衣却不存在发样突起结构[32-33]。Permpoonpattana等[29]发现生物膜形成过程中形成的芽孢缺少芽孢外衣，说明芽孢外衣不稳定。然而也有研究指出芽孢外衣很稳定，只有经超声和 /或蛋白酶处理才会丢失[34]。Pizarro-Guajardo等[35]综合所有研究成果，认为芽孢外衣的稳定性或许与实验采用的菌株及所用蛋白酶不同有关。

2.2 艰难梭菌芽孢壳的形成

艰难梭菌芽孢形成过程中，母细胞将前芽孢裹吞完成后，芽孢壳中各种蛋白质包绕于前芽孢外层，芽孢逐渐成熟，见表1。Pereira等[36]通过对芽孢杆菌的研究发现，SafA、SpoⅣA、SpoⅤM及SpoⅥD等十余种蛋白协助芽孢壳中各种蛋白质在前芽孢周围的准确定位。但艰难梭菌中只存在SpoⅣA和SpoⅤM同源蛋白，且SpoⅤM存在与否对芽孢形成影响甚微[37]，推测可能存在其他蛋白发挥类似作用。Touchette等[38]发现一种新的梭菌纲蛋白质SipL（SpoⅣA interacting protein L），通过羧基末端LysM结构域与SpoⅣA结合，是芽孢壳形成过程中必不可少的。随着蛋白质组学技术的发展，芽孢壳中的其他蛋白质与SpoⅣA、SipL和SpoⅤM的相互作用，有待深入研究。

2.3 艰难梭菌芽孢壳和芽孢外衣中关键蛋白质的作用

研究发现，艰难梭菌芽孢壳和芽孢外衣中蛋白除了作为结构蛋白存在，还与芽孢的抵抗性及免疫原性相关。Ghose等[39]发现，胶原蛋白样糖蛋白BclA1是艰难梭菌芽孢外衣的重要组成部分，但免疫原性较差，不足以诱发保护性免疫反应。Calderón-Romero等[40]通过电镜观察到编码富含半胱氨酸的蛋白质基因cdeC缺失的艰难梭菌芽孢外衣缺少发样突起的芽孢外衣结构，提示CdeC在芽孢壳和芽孢外衣间发挥锚蛋白作用。CotA、CotB、CotCB、CotD、CotE、CotF、CotG、CotL和SodA均作为艰难梭菌芽孢壳的结构蛋白而发挥重要作用[29，41]。另外一项蛋白质组学研究发现艰难梭菌630菌株芽孢外衣中的铁氧化还原蛋白（CD0116、CD0117、CD0118）及黄素氧化还原蛋白（CD1474、CD1524、CD2845）可能赋予艰难梭菌芽孢对化学消毒剂的抵抗性[31]，但还需实验证实。见表1。

表1 艰难梭菌630菌株芽孢壳和芽孢外衣中的重要蛋白质

表1（续）

艰难梭菌芽孢可能通过多种相互作用黏附于肠黏膜细胞表面。芽孢表面（即芽孢壳和芽孢外衣）的疏水作用即是其中的一种[35]。不同研究表明，艰难梭菌繁殖体可与宿主小肠黏膜细胞外基质中的胶原蛋白Ⅰ、血小板反应蛋白、纤连蛋白及玻连蛋白结合，黏附于宿主细胞表面[42-43]。芽孢能否也可与上述蛋白结合，还有待研究。Mora-Uribe等[44]研究发现，艰难梭菌芽孢外衣的发样突起与肠上皮细胞的顶端微绒毛之间存在相互作用，芽孢外衣可能参与芽孢与肠上皮细胞的特异性结合；去除芽孢外衣的芽孢比结构完整的芽孢能更有效地与Caco-2细胞结合，但结合可能是非特异性的。

尽管艰难梭菌芽孢结构研究取得初步进展，但芽孢外衣的组成成分、芽孢外衣在环境中的半衰期、芽孢外衣在芽孢与上皮细胞黏附方面的作用等众多问题，还悬而未决。

3 艰难梭菌芽孢萌发

在适宜的环境中，艰难梭菌芽孢接受一系列信号刺激，可在数分钟内失去皮质及芽孢壳等保护性外壳，恢复成为繁殖体。Setlow等[45]综述，艰难梭菌芽孢必须萌发为繁殖体才可释放毒素，引起肠壁细胞坏死，导致相应的临床症状，见图2。

图2 艰难梭菌芽孢萌发过程示意图

3.1 艰难梭菌芽孢萌发信号

迄今，艰难梭菌是所有产芽孢细菌中唯一利用胆酸作为萌发剂的一个菌种，这也反映了艰难梭菌主要定植于哺乳动物肠道中并引起肠道疾病的一种适应策略[46]。胆酸和鹅脱氧胆酸（CDCA）是人体内的两种主要初级胆酸，与牛磺酸或甘氨酸结合。分泌进入小肠的初级胆酸大部分经肠肝循环被肝脏重吸收用于食物消化，少部分进入大肠并在结肠内微生物组代谢生成的胆盐水解酶作用下脱羟基变为次级胆酸，包括脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）及熊脱氧胆酸（UDCA）等50余种，初级胆酸/次级胆酸平衡失调可促进肠道炎症[47-48]。体内实验[49]和体外研究[50]均证明，胆酸可有效促进艰难梭菌芽孢萌发，CDCA是艰难梭菌芽孢萌发的抑制剂。Thanissery等[51]系统分析了不同胆酸对艰难梭菌芽孢萌发的作用，结果表明CDCA、DCA及LCA及其衍生物对艰难梭菌芽孢萌发的影响十分显著，但不同菌株的敏感性存在差异。在小鼠动物模型中发现，肠道内不同胆酸的平衡状态影响艰难梭菌感染的进程，并且鉴定了一种可产生初级胆酸7α-脱羟酶的裂解梭菌，后者定植的小鼠对艰难梭菌感染的抵抗力增强，并且与肠道内的次级胆酸代谢相关[52]。

3.2 艰难梭菌芽孢萌发共激活剂

胆酸是艰难梭菌芽孢萌发的首要条件，但萌发还需要氨基酸作为共激活剂[53]。Shrestha等[54]发现，甘氨酸是艰难梭菌芽孢萌发最有效的共激活剂，原因可能是艰难梭菌芽孢壁肽聚糖层中四肽侧链的第四位为甘氨酸，而其他细菌为丙氨酸。研究表明，L-丙氨酸、牛磺酸及L-谷氨酰胺等也可作为艰难梭菌芽孢萌发的共激活剂[53-55]。Kochan等[55]发现艰难梭菌芽孢在不含Ca2+的培养基中不能萌发，表明Ca2+是芽孢萌发过程中不可缺少的。由此推测：Ca2+可能和甘氨酸一起促进芽孢萌发，抑或Ca2+是萌发信号下游的辅助因子。后续研究发现在萌发关键分子CspB的晶体结构中没有Ca2+，但Ca2+促进芽孢萌发的作用还有待深入研究[56]。Shrestha等[57]发现，铽也是艰难梭菌芽孢萌发的影响因素，故在芽孢萌发监测实验中应注意氯化铽的使用量。

3.3 艰难梭菌芽孢萌发过程中的关键分子

研究表明，枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌及生孢梭菌等利用芽孢内膜的Ger型萌发剂受体启动芽孢萌发，但艰难梭菌不表达该受体[58]。艰难梭菌利用融合基因cspBA和cspC，编码3种丝氨酸蛋白酶CspA、CspB和CspC。Kevorkian等[59]证实，CspA的催化结构域不完整，但可能控制CspC整合进入芽孢。艰难梭菌利用催化结构域同样不完整的CspC作为胆酸受体，利用CspB蛋白酶向下游传递萌发信号，这在其他细菌中还未曾见到[60]。有趣的是，CspC点突变会改变艰难梭菌芽孢萌发剂的特异性，突变株的芽孢可在含有萌发抑制剂CDCA的培养基中萌发[61]。Shrestha等[62]发现CspA突变的艰难梭菌可在无共激活剂氨基酸的环境中萌发，推测CspA是共激活剂的受体。另有研究发现部分艰难梭菌芽孢在不含胆酸的培养基中也能萌发，表明可能存在其他或更加复杂的芽孢萌发机制[50]。

研究表明，CspB蛋白酶通过切除皮质水解酶pro-SleC氨基末端序列，激活SleC，后者将皮质降解，CaDPA从芽孢核心释放[59，63]，见图2。SpoⅤA在芽孢形成及萌发过程中，作为运输CaDPA的通道，调节芽孢核心内的渗透压。Velásquez等[64]发现，芽孢皮质被SleC降解后，在渗透膨胀作用下，内膜上的SpoⅤA蛋白形成小孔，导致CaDPA从芽孢核心释放。由此可见，艰难梭菌皮质降解先于CaDPA释放，芽孢萌发过程以一种“从外到内”的方式进行。

4 结语

综上所述，艰难梭菌芽孢形成及萌发的大致过程及信号通路逐渐清晰，但仍存在一些问题有待解决，如艰难梭菌如何及在什么时机开始形成芽孢，芽孢萌发特异性蛋白酶如何将胆酸信号处理及传递，还需要更多研究来解答。由于芽孢是艰难梭菌感染性疾病传播和复发的关键形式，了解艰难梭菌芽胞形成、结构及萌发过程，不仅能充分理解艰难梭菌的生命周期，还可提供控制艰难梭菌感染的新靶点。